专题5.3血红蛋白的提取和分离.ppt

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1、专题5DNA和蛋白质技术课题3血红蛋白的提取和分离(一）蛋白质占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物2、组成元素C、H、O、N一、基础知识1、含量3、相对分子质量高分子化合物4、基本组成单位氨基酸5、氨基酸通式RHCCOOHNH26、氨基酸连接方式脱水缩合8、分子结构7、肽键CONH氨基酸肽链蛋白质脱水缩合盘曲折叠（一条或者多条）10、生理功能细胞和生物体的结构物质，是人体发育和组织更新的主要原料，具有运输、调节、免疫、催化等作用，是一切生命活动的主要承担者氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别9、蛋

2、白质结构的多样性①氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨基，另一端只有一个羧基（不计R基上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨基和羧基都是一个②若有个n氨基酸分子缩和成m条肽链,则可形成n-m个肽键,脱去个n-m个水分子，至有氨基和羧基各m个11、相关计算③蛋白质可以含有一条或n条肽链、肽链通过化学键（如二硫键）互相连接，具有不同的空间结构④关于蛋白质相对分子量的计算：n个氨基酸形成m条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为a,那么由此形成的蛋白质的相对分子量为n·a-(n-m)·181、分离

3、生物大分子的基本思路选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子2、蛋白质分离和提取的原理根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质(二）蛋白质的提取3、高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、空间结构4、人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白（三）凝胶色谱法

4、②实例：葡聚糖、琼脂糖3、凝胶1、别名：分配色谱法①性质：一些微小多孔的球体，内含许多贯穿的通道2、概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离①大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道4、凝胶色谱法的原理—分子筛效应③分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离②当不同的蛋白质通过凝胶时，分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢5、具体过程蛋白质

5、分子量的大小4、依据的特性（四）缓冲溶液1、概念在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值的影响，维持PH基本不变2、作用4、缓冲溶液的组分分类①弱酸和弱酸盐组合H2CO3NaHCO3CH3COOHCH3COONa3、缓冲溶液的配制通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液②弱碱和弱碱盐NH3H2ONH4CL③多元弱酸的酸式盐和其他所对应的次级盐NaH2PO4Na2HPO

6、4KH2PO4K2HPO4思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)（五）电泳：1、概念带电粒子在电场作用下发生迁移的过程2、原理②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品

7、中各种分子的分离3、类型琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳4、实例由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶十二烷基磺酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量①应用②聚丙稀酰胺凝胶蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素③原理④SDS作用为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDSSDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—S

8、DS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小⑤SDS作用机理讨论