dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL1的发现与功能研究.ppt

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1、CYTOBAND-BASEDGENESETENRICHMENTANALYSISDETECTEDSPARCL1ASAMOLECULARMARKEROFCOLORECTALCANCERLIVERMETASTASIS结直肠癌肝转移负相关基因：SPARCL1的发现与功能研究葛维挺，虞舒静，胡涵光，张航，陈华溶，郑树浙江大学医学部附属第二医院肿瘤研究所，教育部恶性肿瘤预警与干预重点实验室1研究背景大肠癌是常见的恶性肿瘤之一－－发病率3～5位－－死亡率4～5位大肠癌肝转移－－治疗失败的主要原因之一肝脏－－远处转移的最主要转移部位预后较差，中

2、位生存期为5～10个月大肠癌死亡病人（尸检）可发现36％～81％的肝转移研究目的寻找肿瘤转移相关标志物原发灶与转移灶特性相似转移决定于原发灶通过比较伴肝转移和无转移的肠癌原发灶来寻找转移相关基因BrabletzT,NatureRevCancer2005材料与方法组织类型病例数无转移肠癌组织13伴肝转移肠癌组织12基因表达谱数据，芯片类型：Affymetrix伴肝转移肠癌原发灶组织：经病理证实有肝转移灶无转移肠癌组织：手术后经随访三年以上无复发或转移GSEA：GeneSetEnrichmentAnalysis，基因富集分析方法

3、一种生物信息学方法，用来确定一组预先定义的基因在两组表型不同的样本间是否有表达差异。预定义的基因：如属于同一Pathway的基因,定位于同一Cytoband的基因本研究中用来发现基因表达存在差异表达的染色体区带Subramanianet.al,PNAS,2005基因表达谱数据的GSEA分析表明：4q22为肠癌肝转移相关染色体显带，所包含的基因在无转移和伴肝转移肠癌间表达差异显著SPARCL1基因为4q22中最重要的基因（权重最高）无转移肠癌　　伴肝转移肠癌SPARCL1基本情况定位于人类染色体4q22，基因大小为35kb，由11

4、个外显子和10个内含子组成mRNA长度是3kb，编码664个氨基酸，蛋白质分子量约为71kDa，存在多个糖基化位点分泌型的基质细胞糖蛋白，参与多项机体生理过程，如细胞黏附，细胞增殖，肌肉分化以及B淋巴细胞成熟等在非小细胞肺癌、转移性前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、慢性粒细胞白血病中表达下调，在肝癌中表达上调SPARCL1mRNA的定量，SPARCL1蛋白的免疫组化无转移肠癌,伴肝转移肠癌,肝转移组织中表达情况SPARCL1基因低表达与肠癌肝转移有关表达低：伴肝转移肠癌肝转移灶表达高：无转移肠癌差异显著，P=0.007无转移肠癌S

5、PARCL1mRNA伴肝转移肠癌肝转移灶组织中SPARCL1mRNA定量分析SPARCL1蛋白低表达与肠癌肝转移有关表达低：伴肝转移肠癌肝转移灶表达高：无转移肠癌差异显著，P=0.004SPARCL1蛋白表达差异与mRNA一致无转移肠癌伴肝转移肠癌肝转移灶空白H&ESPARCL1SPARCL1蛋白的免疫组化分析SPARCL1表达载体构建及抗体制备构建带有His标签的原核表达载体pET-22b-SPARCL1构建用于真核表达的逆转录病毒载体pLXSN-SPARCL1合成多肽作为抗原，制备兔多克隆抗体及鼠单克隆抗体SPARCL

6、1蛋白重组表达和纯化pET-22b-SPARCL1转化感受态大肠杆菌E.coli(BL21(DE3)/Polys)扩大培养并以IPTG诱导重组蛋白表达Ni2+金属螯合层析柱纯化SPARCL1功能研究肠癌细胞系中高表达SPARCL1不影响：细胞周期和增殖能力影响：迁移和侵袭能力细胞周期实验细胞增殖实验细胞迁移实验SPARCL1蛋白表达与预后生存分析175例结直肠癌病人P=0.025SPARCL1表达高者预后好SPARCL1表达与生存时间结合其他标志物判断预后多标志物生存分析P53、MAPK、E-cadherin、MSH2、ADC

7、Y-2、Shp2、SPARCL1遗传算法支持向量机P53+SPARCL1的模型可更好判断预后SPARCL1基因的低表达与肠癌肝转移有关SPARCL1基因可能通过抑制细胞的迁移能力影响肿瘤转移SPARCL1表达高低可帮助判断肠癌病人的预后，结合经典肿瘤标志物如P53构建的多标志物模型可更好判断预后SPARCL1为分泌型蛋白，是潜在血清标志物肿瘤原发灶的分子事件是导致转移的主要因素郑树葛维挺芯片分析，mRNA定量分析虞舒静免疫组化，预后分析胡涵光抗体制备，真核表达，细胞实验，动物实验张航动物实验，相关通路分析陈华溶融合蛋白

8、表达与纯化，ELISA谢谢