血管内皮细胞体外培养(赵).doc

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1、血管内皮细胞体外培养1.概述血管内皮细胞（endothelialcell,EC）是衬于心，血管和淋巴管腔内表而的一种单层扁平丄皮细胞。EC极薄，厚度约为0.1-1um,长约25〜50Um,宽约10〜15mm,在体内呈梭形，相邻细胞之间借少量粘合质彼此嵌合，细胞长轴与血流方向平行。其超微结构特点是在胞质屮含有的特殊颗粒，称Weibel-palade小体（内含有与凝血有关的第VIII因子相关抗原）；细胞间有紧密连接的缝隙和连。EC除了能保持血管壁内表面的光滑和通透性外，还有多种牛物学功能：维持正常的血液流动性，分泌多种牛物活性物质，在调节细胞牛长，改

2、变脂质代谢，维持血管壁的完整性，调节血管张力和选择性通透性以及免疫调节方面起到重要作用。EC功能的异常，与血栓形成、动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病及肿瘤扩散，免疫疾病都有密切关系。体外培养屮的EC形态呈“鹅卵石样”镶嵌排列，细胞长满后呈接触抑制现象。2.培养方法EC牛长在血管内表而，由于其所处的独特位置不利于观察和研究，所以体外培养EC显得特别重要，冃前已有多种种属（人、牛、猪、兔、大鼠等），多种组织（脐带动脉、静脉、肺动脉、主动脉、脑毛细血管、心脏毛细血管等）的EC能在体外培养成功。人们将培养器皿预先用明胶或纤连蛋白或胶原等粘附蛋白包被后，形

3、成人工的EC下基质层，可促进EC的粘附与牛长。2.1方法原理用酶消化法，酶消化+机械刮脱法或单纯刮脱法将EC分离下來，在适宜的条件下可贴壁并长成致密单层。2.2介绍几种主要EC的分离2.2.1酶消化法大血管内皮细胞的分离2.2.1.1人脐带动、静脉（或其它大血管）2.2.3在37°C水浴屮，预热培养用的所有无菌溶液，备用。2.2.4在无菌条件下，取健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带（25cm左右，不超过6h）,选择无夹痕、无扭曲、无凝血阻塞的部分，放入含有100U/ml的青霉素和100pg/ml链霉索的D-Hanks液屮，在脐静脉或脐动脉的两端插入磨平

4、的注射器针头用丝线扎紧，用注射器从一端注入D-Hanks液冲洗血管，直到流出的液体无血迹。C.注入0.1%胶原酶(1型)溶液，待血管内残留的D-Hanks液流尽后，用注射器封注另一端针头，继续注入胶原酶溶液，致血管充盈，放入37°C无菌的D-Hanks液中,消化15min后取岀。a.收集血管内酶溶液，并且注入含20%小牛血清的M199培养液(pH7.2)冲洗血管收集合并于同一容器内，以1000r/min离心7〜lOmin。b.去上清液，加入20%小牛血清的M199培养液重新悬浮细胞备用。c.其它大血管如牛主动脉，猪主动脉等，可在无菌下分离，然后用

5、线结扎血管各分支，再依丄述步骤分离EC。2.2.2酶消化法小血管内皮细胞的分离2.2.2.1兔主动脉，大鼠主动脉因血管较小，分支极细，不能采用上述方法消化。将动物主动脉取出后放D-Hanks将血管外的脂肪细组织分离干净，用丝线结扎血管一端，然后用探针顶住该端，将整条血管翻转，使内膜翻在外面。将另一端折入腔内0.5cm，并用丝线结扎紧，以防外膜外露及避免酶液进入外膜腔内。用D-Hanks液清洗干净外翻的内膜面，然后血管浸泡在含0.1%胶原卿溶液的小瓶内，盖丄瓶盖在37°C水浴屮轻轻摇荡消化，使EC离散下来，消化15〜20min后，见酶液稍有混浊，即

6、加入等量的含20%小牛血清的M199培养液，以终止酶的作用。收集消化后的酶溶液以1500r/min离心5mim弃上清，用20%小牛血清Ml99培养液重新悬浮细胞。2.2.3酶消化——机械刮脱法猪主动脉EC的分离麻醉状态下，在颈部切口，分离并剪断颈动脉，放血处死。在无菌条件下，作胸腹联合切口，迅速打开胸腔，分离并取出胸主动脉和腹主动脉，置含D-Hanks液的培养皿屮，尽量去除血管外膜的脂肪和纤维组织，然后用D-Hanks液多次冲洗血管外表及血管管腔内的凝血，再放入新装有D-Hanks的溶液屮。纵何剪开血管，反复冲洗干净血管内壁后，在另一•无菌大培皿

7、屮，滴加薄薄一层0.125%胰蛋白酶和0.01%EDTA的混合消化液，将主动脉内膜而朝下铺在酶混合液ZJL。在37°C条件下，让内膜与酶溶液充分接触并消化10〜20min,再加入含少量20%小牛血清的M199培养液，以终止酶的作用。C.把上述主动脉移至另一无菌培养皿，用小手术刀轻轻将内皮刮下。先顺向有次序地刮内膜1〜2次，然后再横向刮1〜2次，用M199液将内皮细胞收集到离心管中,以1OOOr/min离心7〜lOmin,去上清,用20%小牛血清Ml99培养液重新悬浮细胞备用。2.2.4机械刮脱法血管内皮细胞的分离取长度为20cm的大血管，用D-H

8、anks液将血管内、外冲洗干净后，无菌条件下沿纵轴剪开，使血管内皮朝上向外暴露，再D-Hanks液冲洗2次，然后用刮刀轻轻刮取内膜表而的