《外周血DNA的提取》PPT课件.ppt

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1、外周血中DNA的提取与鉴定实验目的掌握人全血DNA提取的原理和操作步骤。了解DNA基本理化性质。3.初步了解DNA琼脂糖电泳鉴定的方法。实验原理1保证DNA一级结构的完整性;2其他生物分子如蛋白质、多糖和脂类等分子的污染应尽量降低到最低;3尽量去除对后续分子实验有抑制作用的有机溶剂和重金属离子;4其他核酸分子RNA,应根据实际需要处理。DNA提取总的原则实验原理理论上所有真核细胞、原核细胞、病毒等都可以提取DNA。样本选择取决于实验目的。全血是基因组提取中最常见的样本之一。样本来源理化性质核酸是由碱基、戊糖及磷酸组成的生物大分子,分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两类。1.酸

2、碱性核酸分子中有酸性的磷酸基和碱性的含氮碱基,属于两性化合物,但是磷酸基的酸性较强,所以核酸总体上表现为酸性,带负电荷。2.溶解度与粘度核酸是极性化合物,微溶于水,其钠易盐溶于水,而不溶于乙醇、苯酚、氯仿、乙醚等有机溶剂。核酸是高分子化合物,粘度很大。3.紫外吸收核酸有强烈的紫外吸收,其最大吸收峰在260nm处,常以A260表示。实验原理生物的大部分或几乎全部的DNA都集中在细胞核或核质体中,人与动物的DNA主要存在于细胞核中,并与蛋白质结合的构成大小不一的染色体。所以蛋白质是DNA提取过程中常见的污染之一,而且蛋白质污染常常影响到以后的DNA操作过程,因此提取过程中要把蛋白质去除。实验

3、原理本实验中DNA提取采用的是苯酚/氯仿抽提的方法。基本原理就是苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用,而对DNA却没有影响。经苯酚/氯仿抽提后,酚/氯仿相与水相完全分层,蛋白质变性而被离心沉降到酚/氯仿相和水相的界面,DNA则留在水相。标本中的脂类杂质溶解于酚/氯仿相,从而与水相分离得以去除。实验原理此方法提取得到的DNA可能会有RNA杂质,但是RNA极易降解。而且少量的RNA对DNA的后续操作没有大的影响,如有必要可以加入不含DNA酶的RNA酶去除RNA的污染。实验步骤1.首先取EDTA抗凝的人外周血2mL,按照1:5~1:10的比例加入去离子水裂解8min,然后1700rpm/min离

4、心,去掉含有红细胞碎片的上清液,重复裂解一次,留取白细胞沉淀。实验步骤DNA细胞裂解液(pH8.0):150mmol/LNaCl、10mmol/LTris-HCl、10mmol/LEDTA、0.5%SDSDNA细胞裂解液中SDS的是表面活性剂,主要作用裂解细胞膜、核膜,使核膜里与蛋白质结合的核酸释放到溶液里面。另外,Tris盐的作用是使抽提的出来的DNA容易进入水相,减少在蛋白质层的滞留。2.加入0.5mL的DNA细胞裂解液来悬浮白细胞沉淀。实验步骤3.悬浮后的溶液中添加蛋白酶K20µL,65℃水浴0.5h,期间轻缓地倒转几次。4.室温下,添加0.5mL的苯酚/氯仿/异戊醇混合抽提液,剧

5、烈地震荡混合10min,然后8000rpm/min离心10分钟,然后将水相移至新的离心管中。细胞膜裂解以后,细胞中含有的蛋白质和DNA酶等释放到溶液中,而蛋白酶K具有水解蛋白质和DNA酶的作用,并且在EDTA和SDS存在的条件下仍保持较高的活性。在苯酚/氯仿加入少量的异戊醇,可以减少实验中气泡的产生,而且有利于分层,保持分层的稳定性。实验步骤5.添加1mL的预冷的无水乙醇到水相中,混匀,8000rpm/min离心3分钟。加入无水乙醇可以吸收水相中的水分,使得DNA沉淀析出。6.沉淀用70%的预冷乙醇洗涤两次,然后干燥,最后用50µL去离子水悬浮。70%的冰乙醇可以去除可溶性的多糖、金属离

6、子等杂质以及残留的苯酚/氯仿等。实验步骤7.用1%的琼脂糖电泳鉴定所提取的DNA。8.剩余的DNA贮存在4℃冰箱中,备用。注意事项一.提取染色体DNA最根本的要求就是保持核酸的完整性。所以操作过程中要注意:1物理因素高分子量的DNA长而弯曲,仅有极微的侧向稳定性,机械张力和高温很容易使DNA分子发生断裂。因此,实际操作过程中尽量轻缓,尽量避免过度的溶液吹打转移,以及过高的温度。2化学因素在过酸的条件下,由于DNA脱嘌呤而导致DNA的不稳定,容易在碱基脱落的地方发生断裂。因此避免使用过酸的条件。二.步骤3转移水相时,此时的水相可能比较粘稠,必须非常的小心将水相吸入新离心管并防止搅动和吸入分

7、层界面的杂质蛋白。三.在提取过程中,使用离心管及枪头都应该是干净无菌的,相应试剂配制及保存要规范。谢谢!

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