氨基酸检测方法.ppt

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1、氨基酸分析1958Spackman,SteinandMoore第一次实现氨基酸自动分离和定量NH2RCCOOHHUV-210nm氨基酸衍生化方法柱后衍生柱前衍生氨基酸衍生化后的氨基酸试剂色谱柱检测器色谱柱检测器氨基酸试剂色谱柱检测器柱后衍生色谱柱:阳离子交换柱试剂:茚三酮方法---UV/VIS检测器OPA方法---荧光检测器柱后衍生化分离柱阳离子交换柱使用阳离子交换柱，峰分离度较差。分析所有的氨基酸所需时间较长。蛋白质水解氨基酸(45min)生物体氨基酸(120min)茚三酮方法伯氨基酸和仲氨基酸（亚氨基酸）检测:440nm(脯氨酸)o

2、r570nm(primary)反应温度:130℃反应速度:快速试剂稳定性:不稳定（必须冷藏）衍生化产物稳定性:稳定茚三酮方法阳离子交换柱UV/VIS检测器茚三酮试剂130℃氨基酸柱温箱反应器加热器OPA方法(邻苯二甲醛)伯氨基酸检测：荧光检测器(Ex=350nm,Em=460nm)反应温度：室温反应速度：快速试剂稳定性:较差衍生化产物稳定性：较差脯氨酸和羟基脯氨酸分析脯氨酸和羟基脯氨酸不与OPA试剂发生反应在与OPA反应前两种氨基酸应先使用下列试剂进行氧化次氯酸盐氯胺－TOPA衍生反应辅助试剂有硫醇存在时，OPA才会与伯氨基酸发生反应乙

3、硫醇2-硫基乙醇3-硫基丙酸(非挥发性)OPA方法阳离子交换柱荧光检测器氨基酸柱温箱OPA试剂次氯酸盐茚三酮方法和OPA方法比较衍生化后的氨基酸色谱柱检测器柱前衍生色谱柱:反相柱(ODS)试剂:OPA(荧光检测)FMOC(荧光检测)荧光胺(荧光检测)DANS-Cl(荧光检测)PITC(UV)柱前衍生分离柱反相色谱柱(ODS)使用反相柱，色谱峰分离良好。分析某些类型的氨基酸所需时间很短蛋白质水解氨基酸(20min)生物体氨基酸(60min)OPAMethod(o-phthaldialdehyde)伯氨基酸检测:荧光检测器(Ex=380nm

4、,Em=420nm)反应温度：室温反应速度：快速OPA柱前衍生化色谱图生物体氨基酸标准品Shim-packCLC-ODSFMCO方法(9-fluorenylmethyoxycarbonylchloride)通用试剂，用于缩氨酸N端保护荧光胺方法pH＝7时与伯氨基酸快速反应易于水解DANS-Cl方法(1-dimethylaminonaphthalene-5-sufonylchloride)与伯氨基酸和仲氨基酸反应效率低PITC方法(phenylisothiocyanate)ForpeptideandproteinsequencingasE

5、dman抯reagent伯氨基酸和仲氨基酸(碱性条件)反应时间长使用UV检测器，灵敏度低PITCPTCPTC-氨基酸色谱图STRODS-II氨基酸标准品自动氨基酸分析仪对于“柱前”和“柱后”自动氨基酸分析仪来说，采用何种方法更好？要控制反应时间，采用柱后衍生方法更方便。这就是为什么采用柱后衍生法所得结果之重复性更好的原因。柱后衍生重复性,RSD约为1%柱前衍生重复性,RSD>2%Shimadzu氨基酸分析系统氨基酸分析流程图分离柱强酸性阳离子交换树脂(带有磺化基团的苯乙烯－二乙烯基苯共聚物)Na型andLi型Shim-packAMINO

6、-Na，用于水解氨基酸分析Shim-packAMINO-Li，用于生物体氨基酸分析水解氨基酸色谱图生物体氨基酸色谱图流动相[Na型]A溶液:0.2N柠檬酸钠(用高氯酸调pH至3.2)B溶液:0.6N柠檬酸钠/0.2M硼酸(用4MNaOH调pH至10.0)C溶液:0.2NNaOH(用于清洗色谱柱)[Li型]A溶液:0.15N柠檬酸锂/7%甲氧基乙醇(用硼酸调pH至2.6)B溶液:0.3N柠檬酸锂/0.2M硼酸用4MLiOH调pH至10.0)C溶液:0.2NLiOH(用于清洗色谱柱)PH梯度HHHR-C-COOHR-C-COOHR-C-CO

7、O-NH3+NH2NH2分离是通过离子力进行的N-acetylcystine作为辅助试剂什么是氨捕集柱?流动相中的氨无捕集柱有捕集柱重复性(各250pmol)(n=10)线性高灵敏度分离色谱图25pmol氨基酸标准品样品预处理脱脂去蛋白蛋白质水解样品稀释过滤脱脂脂类组分会影响分析柱使用弱极性溶剂乙酸乙酯氯仿正己烷等两相分离后,水相必须使用0.45um滤膜过滤除蛋白蛋白组分会干扰氨基酸的分离除蛋白试剂酸性溶剂方法有机溶剂方法超滤方法蛋白沉淀物必须采用离心(3000rpm,5min)或过滤方法除去.酸性溶剂方法三氯乙酸(5-10%水溶液)高

8、氯酸(0.1-1%水溶液)除去蛋白后,通过加NaOHorLiOH以中和溶液(溶液呈酸性时会影响色谱保留时间.)有机溶剂方法乙腈乙醇聚苯乙烯柱不适合用有机溶剂。如果采用有机溶剂方法,进样量应尽可能小。超滤方法