海洋放线菌基因组文库的构建和功能基因的克隆及序列分析.pdf

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1、LibraryConstructwithGenomicDNAFragmentsandCloningfunctionGeneoffromMarineactinomyceteandSequenceanalysis么砀esisSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementFortheM．S．DegreeinBiochemistryandMolecularBiology{ByMaYanlingPostgraduateProgramCollegeofLifeSciencesCentralChina

2、NormalUniversitySupervisor：QiChaoLiAiyingAcademicTitle：Professor,AssociateProfessorSignature盈j幽ApprovedMay,2011f⑨硕士学位论文MASTER’STHESIS华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中

3、以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。日期：Pot／年夕月-70日学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解华中师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华中师范大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后遵守此规定)保密论文注释：本学位论文属于保密，在——年解密后适用本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范

4、围，适用本授权书。、厶作者签名：a锨导师签名：忉兰暨日期：测f年罗月=}。日日期：》叫年步月弓6日本人已经认真阅读“CALIS高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论文提交“CALIS高校学位论文全文数据库"中全文发布，并可按“章程”中的规定享受相关权益。回童途塞握童后进卮；旦圭生；．旦二生；旦三生蕉查!作者签名：召锨日期．幻忤岁月弓DE1，1／基”却牙名“娩m师期宁日⑨硕士学位论文MASTER’STHESIS以稀有海洋放线菌Salinisporaarenicola和Streptomycessp．为实验材料，随机机械剪

5、切提取的总DNA，5’．磷酸末端补平回收40kb左右的DNA片段，与pWEB珊载体连接，经包装蛋白包装成噬菌体后侵染宿主细胞E．coliEPI啪，构建该菌株的基因组文库，并对该文库进行质量鉴定。稀有海洋放线菌Salinisporaarenicola的基因组文库的效价达6．5x104CFI7／mI，，得到3,000个阳性克隆子，远远大于按覆盖率为99．9％计算至少所需的1380个阳性克隆子数，且平均插入片段长度为36kb，重组率接近100％。成功构建的稀有海洋放线菌Streptomycessp．的基因组文库，效价达9．0x104CF

6、U／mL，得到4000个阳性克隆子，远远大于按覆盖率为99％计算至少所需的837个阳性克隆子数，且平均插入片段长度为36kb，重组率同样接近100％。阳性克隆子保存于96孔板中，．80℃保存。所构建文库的各项指标均达到要求，为了进一步评估Salinisporaarenicola和Streptomycessp．所能合成的所有潜在天然产物，还需要进一步检测该文库中包含有生物合成基因簇的大肠杆菌的表达情况。实验后期成功克隆了稀有海洋放线菌Salinisporaarenicola的非核糖体肽合成酶(NI冲S)和卤化酶生物合成基因簇核心区基

7、因片段。根据己发表的放线菌NRPS和卤化酶生物合成基因簇核心区的核苷酸序列保守区设计两对简并性引物，采用PCR的方法扩增NRPS和卤化酶生物合成基因簇核心区基因片段，并使用分子生物学软件进行了序列分析。所获得的两段基因片段大小分别为660bp和555bp，分别编码220个和185个氨基酸。这两段序列与海洋放线菌SalinisporaarenicolaCNS．205的NRPS和卤化酶生物合成基因簇核心区基因核苷酸序列的同源性分别为99％和98％。最终成功地获得了稀有海洋放线菌Salinisporaarenicola的NRPS和卤化酶

8、生物合成基因簇核心区基因片段，该基因片段的获取将为分离全长基因簇以及研究该基因簇在生物合成中的功能奠定基础。化关键词：海洋放线菌；基因组文库；腺苷酰化结构域；色氨酸卤代酶；系统进⑨硕士学位论文MASTER’STHESISAbstractRarema