实验六-细菌的生理生化试验.ppt

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1、实验六细菌的生理生化试验9/16/2021一、目的1、了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理。2、掌握细菌生理生化试验的方法。9/16/2021二、原理由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不相同，也就是说，不同微生物具有不同的酶系统。即使在分子生物学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。9/16/2021三、材料1菌种大肠埃希氏菌（Escherichia col

2、i）、产气肠杆菌、沙门氏菌的斜面菌种。2培养基葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、三糖铁琼脂斜面等。9/16/20213试剂5%的α-萘酚溶液、40％KOH溶液、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚。4器具超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、接种环等。9/16/2021四、流程糖类发酵试验→V-P试验→M.R试验→吲哚试验→硫化氢试验→三糖铁（TSI）琼脂试验9/16/2021五、步骤(一)糖类发酵试验1目的了解不同细菌分解利用糖的能力及实验原理，并掌握其操作方法。9/16/2

3、0212原理可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察是否产生气泡来判断。9/16/20213材料3.2菌种大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes）、沙门氏菌的斜面菌种3.３　培养基葡萄糖和乳糖发酵培养液试管9/16/2021４

4、流程发酵液试管→标记→接种→培养→观察→记录9/16/20215步骤5.1试管标记取分别装有葡萄糖和乳糖发酵培养液试管各4支，每种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、沙门氏菌和空白对照。9/16/20215.2接种以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。置37℃恒温箱中培养，分别在培养24h、48h、和72h观察结果。9/16/20219/16/20219/16/20215.3观察记录与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记

5、录用“－”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“－”表示。9/16/2021(二)、乙酰甲基甲醇试验(V．P试验)1.目的检测细菌能否利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。了解鉴别不同肠杆菌科各菌属的乙酰甲基甲醇试验原理，并掌握其操作方法。9/16/20212原理葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇二乙酰与胍基生成红色化合物某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解

6、葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。9/16/20213材料(1 )、菌种大肠埃希氏菌、产气肠杆菌、沙门氏菌的斜面菌种(2)、培养基葡萄糖蛋白胨水培养基(3)、试剂V-P指试剂9/16/2021４流程培养液试管→标记→接种→培养→观察→记录9/16/20215步骤（1）、标记试管取4支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、沙门氏菌和空白对照。9/16/2021（2）、接种培养以无菌操

7、作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37℃恒温箱中，培养48～72h。9/16/2021（3）、观察记录取出以上试管，先加甲液（6%的α-萘酚溶液）0.5毫升,再加乙液（40％KOH溶液）0.5毫升,充分混匀,静置15min后，若培养液呈红色者，记录为V.P.试验阳性反应（用“＋”表示）；若不呈红色，记录为V.P.试验阴性反应（用“－”表示）。1小时后可出现假阳性。9/16/20219/16/2021（三）甲基红试验（M.R.试验）1、目的检测细菌能否分解葡萄糖产生有机酸的能力。了解鉴别肠杆菌科各

8、菌属的甲基红试验原理，并掌握其操作方法。9/16/20212、原理肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。9/16/20213、材料（1）、菌种大肠埃希氏菌（Escherichia co