RP-HPLC法测定大鼠血浆中维生素D3的研究.pdf

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1、第2期总第260期农业科技与装备No.2TotalNo.2602016年2月AgriculturalScience&TechnologyandEquipmentFeb.2016RP-HPLC法测定大鼠血浆中维生素D3的研究*冯欢欢,张一凡,任雪,徐彩红(沈阳师范大学粮食学院食品系,沈阳110034)摘要:建立一种维生素D3(VD3)在大鼠体内浓度的测定方法,为食品中营养素的生物利用研究奠定基础。采用RP-HPLC法进行检测分析;采用甲醇沉淀蛋白结合乙醚液液萃取法进行血浆样品处理。结果表明:低、中、高3个浓度VD3的提取回收率分别为8

2、7.8%±5.14%,85.4%±3.00%和89.6%±5.71%;日内、日间的精密度分别小于5.12%和6.30%。该方法灵敏度高、稳定性好,可作为食品、药学研究中大鼠体内吸收动力学相关试验研究的检测分析方法。关键词:高效液相色谱法;25-羟基维生素D3;大鼠血浆中图分类号:R446.1文献标识码:A文章编号:1674-1161(2016)02-0047-03维生素D(VitaminD,VD)是一种脂溶性维生素,可调波长紫外检测器和工作站:美国Agilent公司;见光极易分解,其作用主要是调节人体内钙和磷的代AvantiJ-E离

3、心机:BECKMANCOULTER公司。[1-2]谢,促进其吸收利用,促进骨骼成长。VD的主要活1.4试验方法性形式有25-羟基维生素D3[25(OH)VD3],1,25-二1.4.1色谱条件色谱柱:ODSHYPERSILC18色谱柱羟基维生素D3[1,25(OH)2VD3]和24,25-二羟基维(200.0mm×4.6mm,5μm);流动相:甲醇—水(98∶2,生素D3[24,25(OH)2VD3]3种。其中25(OH)VD3为V/V);柱温:35℃;流速:1.0mL/min;检测波长:265血液中VD的主要循环形式,是显示VD状

4、况的一个nm;进样量:20μL;仪器灵敏度:0.001AUFS。[3]最佳指标,但其在血清中浓度相当低,一般检测方1.4.2血浆样品处理精密量取大鼠血浆100μL,置[4-5]法无法检出。为此,本课题参考相关文献,建立一10mL具塞离心试管中,加入甲醇200μL,涡旋混合种利用高效液相色谱法检测维生素D3(VD3)的方法。1min,加入无水乙醚2.0mL,涡旋3min,6000r/min1材料与方法离心5min,吸取有机层1.5mL置另一5mL试管中,1.1试剂残液中再加入无水乙醚2.0mL。重复上述提取过程,维生素D3(VD3,纯

5、度99.9%):中国食品药品检合并两次提取液,于40℃水浴中氮气吹干。残留物用定研究院;羧甲基纤维素钠(CMC-Na):上海永日药100μL流动相溶解,涡旋振荡3min,将溶液转移至品贸易有限公司;甲醇(色谱纯):山东禹王化工制品1.5mLEP离心试管中,12000r/min离心10min,取有限公司;无水乙醚(分析纯):天津凯信化工制品有上清液20μL进样,记录药物峰面积,并代入当天制限公司;其他试剂均为分析纯;水为自制二蒸水。备的标准曲线中,计算血浆中药物浓度。1.2供试动物2结果与分析雄性Wistar大鼠,体质量220±30g

6、,由沈阳药科2.1色谱行为大学实验动物中心提供。在本试验所采用的色谱条件和血样处理方法下,1.3仪器设备大鼠空白血浆色谱图见图1中A;一定浓度的VD3溶1200系列高效液相色谱仪,包括1200泵系统和液加入空白血浆中的色谱图见图1中B,VD3的保留时间为8.165min;大鼠给药后某时间点的血浆样品收稿日期:2015-10-17色谱图见图1中C。结果表明:血浆中的内源性物质作者简介:冯欢欢(1994—),女,从事食品营养素检测与分析方面的研究工作。不干扰血浆中药物浓度测定。药物色谱峰的理论板数通信作者:徐彩红(1979—),女,博士

7、,讲师,从事营养素组分均不低于2000,药物与杂质峰的分离度大于2.0。间的相互作用方面的研究工作。48农业科技与装备2016年2月VD3低、中、高3个浓度下的提取回收率均高于80%。表1大鼠血浆中VD3测定方法的准确度和精密度(n=6)Table1AccuracyandprecisionofVD3determinationmethodinratsplasma(n=6)日内日间VD3浓度/χ±S.D./χ±S.D./(μg/mL)RSD/%RSD/%(μg/mL)(μg/mL)A0.400.40±0.0163.930.37±0.02

8、36.301.001.03±0.0525.120.98±0.0575.832.002.00±0.0371.861.94±0.0392.02表2大鼠血浆中VD3的提取回收率(n=6)Table2Extractionrecoveryrat

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