大鼠胰岛素Ⅱ基因启动子克隆与功能验证.pdf

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1、南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2014,45(10):1861—1865ISSN2095—1191;CODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.cnDOI:10.3969/j:issn.2095—1191.2014.10.1861大鼠胰岛素Ⅱ基因启动子克隆与功能验证韦玲静,黄碉萌,严雪瑜,蒋钦杨+,兰干球,郭亚芬(广西大学动物科学技术学院,南宁530005)摘要:【目的】克隆大鼠胰岛素II基因启动子(PdP2)序列并对其功能进行验证,为培育胰岛特异性表达外源基因的转基因动物奠定基础。【方法】根据Ge

2、nBank中已发表的R/P2序列(J00748.1)设计引物,以大鼠基因组DNA为模板,PCR扩增R/P2序列,连接pMDl8.T载体后用H/ridIII和BamI-II进行双酶切,回收R/P2片段并连接至不含启动子的pEGFP.1载体上构建真核表达载倒kpEGFP.1.R/P2。重组质粒转染PKl5细胞,24hA观察细胞荧光蛋白表达情况。【结果】克隆获得的R/P2序列与参考序列(J00748.1)的同源性为99.9%,存在3处碱基差异,即从起始密码子ATG(+I)上游.57处有一个G碱基缺失,.387处c突变为A,.707处插入一个G碱基。mP2序

3、列存在一个TATA.box(.206---201位点)和一个CAAT.box(.343~一339位点)。以重组质粒pEGFP.1.剐P2转染PKl5细胞,24hA能观察到绿色荧光。【结论】克隆获得的大鼠R/P2序歹IJ具有启动子功能,但活性较CMV启动子弱。关键词:大鼠;胰岛素Ⅱ基因启动子;克隆;功能验证;真核表达载体中图分类号:Q785文献标志码:A文章编号:2095一1191(2014)10—1861—05Cloningandfunctionalverificationofrat-⋯·insulin2genepromoterWEILing-jin

4、g,HUANGYue-meng,LANGan-qiu.YANXue—yu,JIANGQin-yang+,GUOYa—fen(CollegeofAnimalAcienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning530005,China)Abstract:【Objective】CloningandfunctionalverificationofRatinsulin2promoter(R艘)wereconductedtolaythefoundationforbreedingtransgenicanimalsofspec

5、ificexpressiontargetgenesofinsulin.【Method】AccordingtotheR胞sequence(No.J00748.1)waspublishedinGenBank,apairofprimerwasdesignedtoamplifytheRIP2sequencebyPCRmethod.TheRjP2sequencewasconnectedtothepMDl8一Tvector.therestructuringvectorwasdoublydigestedby/-//ndIIIandBamHI,andthenther

6、ecyclingRIP2sequencewasconnectedtopEGFP—lvectortoconstructthepEGFP—l—RIP2expressionvector.TheconstructingvectorwastransfectedintoPKl5cells.andfluorescentproteinexpressionincellswasobservedafter24houm.【Result】TheclonedRJP2sequencewas703bp(一87l一一169sites)inlengthandhad99.9%ofhomo

7、logyt}lereferencesequence(No.J00748.1).r11lereexisted3basemutations,frominitiationcodonATGupstream(+1).Gbasedeletionwasat一57site,C/Amutationat一387site,Gbaseinsertionat一707site.TheRJP2sequencecontained2promoterelements:TATA—box(一206一一201sites)andCAAT—box(一343N--339sites).Greenfl

8、uorescenceWasobservedfromthePKl5cellstransfectedpEGFP—

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