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《酶高产和低产菌株糖化酶基因调控区的克隆及其分析比.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、,微生物学报36(3):181一2861996刀cta几几crobi0I口gica51月介a黑曲霉糖化酶高产和低产菌株糖化酶基因调控’区的克隆及其分析比较钟丽蝉乔殿华唐国敏杨开宇(中国科学院微生物研究所北京100080)摘要以R合成的糖化酶高产菌株黑曲霉(A.niger)T21糖化酶基因’5近端非编码区CPsP,588饰(欣。R卜aBmHI)的序列为探针从2T1染色体DNA中克隆到近ZDkb的糖化酶基因’5端.非编码区序列,并以此序列为探针从糖化酶低产菌株黑曲霉3795(T21的诱变出发株)的染色体.DNA中克隆到1skb的糖化酶基因。二,’5端非编码区序列该序列的分析测
2、定结果表明其结构,“”特征与文献报道的黑曲霉糖化酶基因夕端非编码区的基本一致被称为核心启动子(Coerp价,。,moe)tr的ATTAAAT框及GCAAT框分别在翻译起始点的一109bP及一178饰处此外在曲。霉a刀lds八mlyB基因中已发现有调控功能的CcAAT序列存在于-科9饰和一799bP处高产和低产菌株糖化酶基因,9。5’端非编码区序列的分析比较结果表明有个部位的碱基发生了变化此实验结果为进一步研究黑曲霉糖化酶基因在转录水平。上的调控规律打下了基础关键词黑曲霉,糖化酶,’5端非编码区,。,黑曲霉糖化酶是诱导酶淀粉能诱导酶的形成已有的研究结果表明培养基中淀粉浓度与
3、糖化酶活力及糖化酶mRNA含量呈正相关。黑曲霉糖化酶高产菌株与低产菌株的酶活一。,,力与糖化酶mRNA含量比也有一致的对应关系因此与已研究的其他丝状真菌jI一样黑_曲霉糖化酶的基因表达也主要在转录水平仁受调控。黑曲霉糖化酶基因启动子是丝状真菌中已知的几个强启动子之一,因而是目前丝状真菌表达载体使用最多的启动子之一。通过黑曲霉糖化酶高、低产菌株糖化酶基因’5端非编码区序列的比较及进一步的研究不仅可发现重要的基因顺式调控元件,为深人研究参与糖化酶基因转录的蛋白质因子及最终阐明其转录水平上的调控规律奠定基础,同时还可直接指导构建外源蛋白高效表达载体和工业丝状真菌育种。因此,获得
4、。l2[已报道黑曲霉黑曲霉糖化酶基因’5端非编码区序列是必要的第二步前文糖化酶高产菌株糖化酶结构基因的分离及序列测定,本文报道黑曲霉糖化酶高、低产菌株糖化酶基因’5端非编码区序列的克隆及两序列的分析比较结果。1材料和方法LI材料...111菌株及质粒:黑曲霉(AsP。ig尽日TZI为中国科学院微生物研究所糖化酶研究小组*国家自然科学基金资助项目。本文于份95年4月17日收到。182微生物`学报36卷经多次诱变所获得的糖化酶高产菌株;黑曲霉795.,3为本组保存的糖化酶低产菌株是;E.c。DHS,;pGalpsTZI的诱变出发株大肠杆菌(1)为本组保存用作宿主菌质粒,,含有
5、PcR合成的黑曲霉糖化酶基因5’近端非编码区序列由本组构建l3]用于制备hern;pUC19用oSut印迹分析及原位杂交所用之探针质粒作克隆及序列分析中亚。克隆的载体.。。.12培养基:细菌生长培养基为LB培养基黑曲霉TZI及3795摇瓶培养基同前文l2]1.1.3酶及其他试剂:限制性内切酶、连接酶、碱性磷酸醋酶为Boehrn、ignerManhnie、、、oaNdiBolsrPmagewnEglanab华美生物工程公司中国医学科学院基础医学研究所友。a。谊生物制品公司产品切刻平移试剂盒为rPomag公司产品DNA序列分析试剂盒7euenearaca。’Z,,。(TSqi
6、gnkit)为phmi产品同位素P及s为Dupont公司产品LZ方法..,。121染色体DNA制备:参照文献4[]所述方法用氯化节提取菌体培养及菌丝体收集方法同前文2IJ。.、、、、、1.22质粒制DNA片段DNA片段脱DNA连接Son备分离回收磷转化uther印迹分析及原位杂交均按文献【5]所述进行。.,。:71.23核酸序列分析以双链DNA为模板按TSequecningikt操作程序进行2结果和讨论.o21Suthern印迹分析已分离到黑曲霉糖化酶高、低产菌株糖化酶基因从翻译起始密码ATG到’5端上游,RI位点间204bp的旁侧序列2I]本工作拟分离R工位点上游更长片
7、段的’5旁侧序coEcoE。all〕,列以plGaps质粒的Ec0RI一BHl片段(58bP)3I]为探针对Ec0RI完全酶切的黑曲ou,霉TZI染色体DNA作Sm印迹分析结果表明~.2okb的欣。R工一B刀Rl片段含有het。,黑曲霉糖化酶基因’5旁侧序列(图略)同样黑曲霉3795的染色体DNAsouthern印迹分,.__。析结果表明1skb的hxol一〔沁。Rl片段含有黑曲霉糖化酶基因5’端L游序列(图略).22黑曲舞TZI及.3795糖化酶基因’5端非编码区序列的克隆黑曲霉TZI染色体DNA用EcoRI完全酶切,电泳分
