临床医学毕业论文帕金森病细胞模型中膜联蛋白a7氧化修饰水平的变化.doc

《临床医学毕业论文帕金森病细胞模型中膜联蛋白a7氧化修饰水平的变化.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、XX大学毕业论文帕金森病细胞模型中膜联蛋白A7氧化修饰水平的变化2014年6月25日帕金森病细胞模型中膜联蛋白A7氧化修饰水平的变化作者：张颖赵玳王春艳常明胡林森【摘要】H的探讨膜联蛋白A7氧化修饰水平变化在帕金森病(PD)发病机制屮的可能作用。方法应用10gmol/LPSI处理PC12细胞24h建立PD细胞模型。通过2,4二硝基苯脐(DNP)的衍生将含有拨基的氧化蛋白质标记上。首次采用2D凝胶电泳、质谱鉴定与免疫印迹技术相结合的方法比较PD细胞模型和正常对照组屮膜联蛋口A7氧化修饰水平的变化。结果与对照组比较，PD细胞模型屮膜联蛋白A7氧化修饰水平

2、显著降低(P0.05)o结论膜联蛋白A7氧化修饰水平变化可能为PD发病机制的研究提供新线索。【关键词】帕金森病;膜联蛋白A7;发病机制;氧化修饰;蛋白质组学鉴定研究表明，帕金森病(PD)黑质多巴胺能神经元内蛋白质拨基水平显著升高〔1)。因此，H前多数学者将兴趣集屮于氧化应激损害，认为氧化应激在PD黑质多巴胺能神经元死亡过程屮起重要作用。迄今为止，尚未见膜联蛋白A7(annexinA7)发生氧化修饰的报道。本实验通过2,4二硝基苯井(DNP)的衍生步骤将含有拨基的氧化蛋白质标记上，血后采用2D凝胶电泳、质谱鉴定与Western印迹技术相结合的方法首次发

3、现了annexinA7氧化修饰。期望为PD发病机制的研究及治疗药物的研发提供线索。1材料与方法1」材料与仪器PC12细胞购自小国科学院上海细胞库。高糖DMEM培养基购自Gibco公司。新生牛血清由杭州四季青生物制品厂生产。叮唳橙、二抗、显色液等购自Sigma公司。渙化乙噪为Amresco产品。荧光倒置相差显微镜为日本Olympus产品;低温高速离心机为HeraeusSepatech产品。DNP购口东京化工业株式会社。一抗购自MolecularProbe公司。硝纤膜、Cleanup及2DQuant试剂盒、固相13cmIPG胶条、聚焦仪、电泳系统、凝胶图

4、像扫描仪、2DEvolution分析软件和质谱仪为AmershamBiosciences公司产詁。1.2方法1.2.1PD细胞模型的建立PC12细胞复苏后，以2xl05/ml的密度接种于底面积25cm2的塑料培养瓶（10ml/瓶）,于3TC、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。每2〜3d更换1次培养液。选取对数生长期细胞进行传代。细胞以lxl05/ml密度接种于底面积25cm2的議料培养瓶。24h后更换培养液，实验组加入终浓度10屮nol/L的PSI（以DMSO溶解），对照组加入DMSO,实验组与对照组DMSO终浓度均为0.1%,继续孵育24h后收集

5、两组细胞用于实验。MTT法检测细胞存活率;吓噪橙和溟化乙唳染色观察细胞凋亡的存在;HE染色观察细胞内包含体的形成。1.2.2蛋白样品的制备倾去培养液，以冷PBS洗涤3次，计算细胞重量。按重量比1:10加入裂解液，室温作用1ho离心30min,收集上清液。应用Cleanup试剂盒去除杂质,2DQuant定量试剂盒进行蛋白质定量（样甜浓度控制在5〜10mg/ml）o1.2.3一向等电聚焦电泳及IPG胶条的DNP衍生240pg样品与一向电泳缓冲液混合后均匀加入胶条槽，IPG胶条胶面朝下放入胶条槽，在电泳仪上进行水化及等电聚焦电泳。而后将IPG胶条在含20m

6、mol/LDNP的2mol/L的HC1溶液中室温孵育20min,而后在含30%甘油的2mol/LTrisBase溶液中洗15min。1.2.4二向凝胶电泳将平衡后的IPG胶条转移至12.5%SDSPAGE凝胶（16cm><15cmxl.Omm）上端，在垂直电泳仪上进行二向电泳。待溟酚蓝距底边约4cm时停止电泳。1.2.5分析胶进行免疫印迹染色将用作分析胶的二向胶电转移至硝酸纤维素膜。以3%BSA/TBST封闭硝酸纤维素膜。以1：200的兔抗鼠DNP抗体作为一抗，4C过夜孵育。以1:10000的羊抗兔碱性磷酸酶偶联抗体作为二抗,室温孵育lh。以BCIP

7、/NBT溶液作为显色液，至蓝紫色蛋白点清晰呈现后，以双蒸水终止反应。1.2.6制备胶进行热考马斯亮蓝染色制备胶于20%TCA'

8、»固定2h以上。蒸倔水漂洗凝胶20min,加入热考染液，50°C摇床振荡30min。加入脱色液，50°C摇床振荡脱色，每次lh,以背景蓝色脱净为止。1.2.7图像分析、统计学处理及质谱鉴定扫描Western印迹及考染的制备胶图像，应用ImageMaster2DEvolution软件进行分析，在制备胶上找到与Western印迹结果相兀配的蛋白点。以单个蛋白抗DNP免疫染色强度/制备胶蛋白考染强度来标准化蛋白的氧化水平，对来自4

9、次重复实验的结果以x±s表示，采用t检验。对与对照组比较PSI处理组氧化水平有显著差异的蛋白点进一步做质谱鉴