间接免疫荧光检测PBMC.ppt

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1、间接免疫荧光-----检测人外周血单个核细胞武汉大学基础医学院免疫学教研室熊洁原理间接免疫荧光法是用荧光素标记Ab2以检测Ag或Ab的一种实验技术。其原理是Ag首先与Ab1结合，然后Ab1再与荧光素标记的Ab2结合，形成一个Ag-Ab1-荧光素标记Ab2的三分子复合物，在荧光显微镜下呈现荧光。外周血单个核细胞分离------葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法[原理]外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞、单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同。红细胞和多核细胞比重较大，为1.092左右，而淋巴细胞和单核细胞比重为1.075左右。利用比重为1.077左右的分层液作密度梯度离心，使一定比重

2、的细胞按密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。[材料]1、淋巴细胞分层液（葡蔗糖-泛影葡胺，比重为1.077±0.001g/L）2、2％台盼蓝染液3、Hank’s液或者RPMI-1640培养基4、试管、吸管、水平离心机等[方法]1、无菌采集静脉血2ml注入盛有2mlHank’s液（含100u/ml肝素）的试管中，混匀。2、吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中，再将稀释抗凝血液小心沿管壁加至分层液上，应注意保持两者界面清晰。（关键）3、室温2000r／min离心20min。管内可分为四层。4、用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单个核细胞，加入另一支已含有2-5mlHank’s液的离心管中，混匀。

3、5、室温下，1500rpm离心10min。6、弃上清，重复洗涤一次。用完全RPMI-16401ml定容，计数细胞，调整细胞浓度。一般每ml血可分离出1-2×106个单个核细胞。7、细胞活力检查取1滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液，作湿片高倍镜检，计算活细胞百分率。活细胞不着色，死细胞染成蓝色。一般活性应在95％以上。材料1.AgPBMC2.Ab1兔抗人白细胞血清(Ab1)3.Ab2FITC-抗兔单克隆抗体(Ab2)4.洗涤液5.荧光显微镜方法1.制备抗原片:吸管取1滴PBMC液体（约10ul）滴加到标本片黑色圈圈背面中央,静止5-10分钟，待PBMC干燥。2.15ulAb1加入玻片上37℃

4、孵育30min。PBS洗3次(3min/次)。3.玻片上加15ml荧光二抗(Ab2)湿盒内37℃孵育30min。PBS洗3次(同上,避光操作)4.用吸水纸印干玻片，滴油，荧光镜显微镜下观察。结果在荧光显微镜下呈绿色荧光者为阳性。