水牛IFN-γ在毕赤酵母中的表达及其单克隆抗体的制备.pdf

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1、动物医学进展,2013,34(6):71—77ProgressinVeterinaryMedicine水牛IFN一在毕赤酵母中的表达及其单克隆抗体的制备邹新峰。,郭爱珍,陈颖钰h。,胡长敏,王冰。,刘晓乐。,谢倩,姜勇。,张策,陈焕春(1.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,湖北武汉430070;2.华中农业大学动物医学院,湖北武汉430070;3.华中农业大学动物科技学院,湖北武汉430070)摘要:本研究旨在建立水牛IFN一(BubalusbubalusIFN一,BbIFN~7)体外释放检测法,为定量检测水牛IFN一、开发水牛结核病及其他疫病的检测技术奠定基础。克隆了水牛IFN一了

2、成熟肽基因片段,根据测序结果,在不改变氨基酸序列的情况下,将密码子替换成毕赤酵母偏爱密码子并合成全基因,进一步用毕赤酵母GSI15表达了水牛IFN一成熟肽基因。通过水疱性口炎病毒(VSV)在牛肾细胞(MDBK)上检测了其抗病毒活性,抗VSV活性为7.44×10U/mL。利用酵母表达的水牛IFN一7蛋白免疫Balb/c小鼠,并筛选阳性杂交瘤细胞,获得5株高效价的单克隆抗体。利用该重组蛋白免疫日本长耳大白兔,得到高效价的抗水牛IFN一多克隆抗体。用所获得的单克隆抗体及多克隆抗体建立了检测水牛IFN一7的双抗体夹心ELISA方法,检测灵敏度达到125pg/mL。通过建立的方法分别检测了原核表达的

3、奶牛IFN一7、梅花鹿IFN—y、弥猴IFN一7以及其他7种非相关重组蛋白,结果表明所建立的方法灵敏度高,特异性好。关键词:水牛;干扰素;毕赤酵母;双抗体夹心酶联免疫吸附试验;单克隆抗体中图分类号:$852.4文献标识码:A文章编号:1007—5038(2013)06—0071—07了干扰素(interferon一,IFN一7)是一种多功能密切联系,医学及兽医学上常利用检测IFN一进行生物活性多肽,具有抗感染、抗肿瘤活性和免疫调节传染病诊断。该方法灵敏度与特异性较高,显示等作用,如活化巨噬细胞、提高MHC工类和MHC出很大的应用前景[。],其基本原理是曾经感染或发Ⅱ类分子的表达、促进抗原提

4、呈等,在机体抗感染与过病的人或动物,其T淋巴细胞被该病原如结核分免疫中发挥重要作用Ⅲ。基于IFN一与感染之间的支杆菌致敏,当在体外再次遇到相同抗原时,T淋巴收稿日期:2012—07—17基金项目:公益性行业科研专项“布鲁氏茵病、牛结核病防控技术研究”(200903027);家畜生产运输过程中环境应激响应及调控技术研究(201003060)作者简介:邹新峰(1984一),男,山东临沂人,硕士研究生,主要从事动物传染病学研究。*通讯作者DeterminationofEffectiveConstituentContentinToltrazurilNanoemulsionbyHPLCZHANGZh

5、i—mei,DENGXu—ming,SHENZhi—qiang。(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,JilinUniversity,Changchun,Jilin,130062,China;2.ShandongBinzhouAnimalScience&VeterinaryMedicineInstitute,Binzhou,Shandong,256600.China)Abstract:Todeterminetoltrazuri1contentintoltrazurilnanoemulsionbyHPLC,samplesweresepa

6、ratedbyAgilentC18column(4.6mmX150mm,5m),themobilephaseconsistedofpotassiumdihydrogenphos—phatebuffer(pH3)一acetonitrile(45:55)withflowrateat1.0mL/min.UVdetectionwavelengthwassetat240nm,columntemperatureat30℃,andsamplesizewas20uL.Thelinearrangeoftoltrazurilwas0.0625/~g/mL一100/~g/mL.Thelimitsofdetect

7、ionandquantificationwere5ng/mLand15ng/mL.re—spectivelyandtheaveragerecoverywas99.73%.Theresultsshowedthatthemethodissimple.sensitive.accurate,andcanbeusedforthequalitycontroloftoltrazurilintoltrazurilnanoemulsion

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