松材线虫乙酰胆碱酯酶1基因沉默及蛋白抑制剂.pdf

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1、第51卷第1期林业科学Vo1．51，No．12015年1月SCIENTIASILVAESINICAEJan．，2015doi：10．11707／j．i001—7488．20150107松材线虫乙酰胆碱酯酶1基因沉默及蛋白抑制剂刘立宏王峰马玲王步勇陈俏丽刘晓晗董婉莹薛羿(东北林业大学哈尔滨150040)摘要：【目的】为提高苦参碱的杀虫效果，对松材线虫的药剂防治靶标乙酰胆碱酯酶l基因(BxACE1)进行研究。【方法】松材线虫采集自广东省内马尾松，贝曼漏斗法分离，灰葡萄孢菌苔上25℃避光培养扩繁线虫。克隆BxACE1基因全长并进行序列分析，通过基因沉默和蛋白抑制2种技术

2、阻断该基因功能，研究苦参碱的杀虫效果，并应用Q—PCR技术鉴定RNAi效果。【结果】5和3序列拼接得到基因全长2145hp，命名为BxACE1。同源序列多序列比对表明线虫ACE的进化速度与线虫进化速度一致。蛋白质三维结构分析表明，BxACEI由i4个OL螺旋包围着l3个B折叠，鉴于氢键数量越多结合越稳定，利用docking技术筛选出石杉碱甲是松材线虫乙酰胆碱酯酶1蛋白的较佳抑制剂。RNAi明显增加了苦参碱的杀虫效果，石杉碱甲本身对线虫毒性较小，共同施用RNAi和石杉碱甲对线虫毒性仍然较小，但RNAi处理组线虫与Inhibitor(0．03％苦参碱+1p,mol·L

3、I1石杉碱甲处理线虫)处理组线虫在24，48及72h存活率差异不显著，表明石杉碱甲处理线虫和BxACEI基因RNAi处理效果相近。【结论与其他】通过基因沉默和蛋白抑制2种技术阻断BxACE1功能均可以提高苦参碱的杀虫效果，RNAi技术能够简单易行地证明若阻断BxACE1功能可以提苦参碱的杀虫效果，但dsRNA容易降解等因素限制了该技术在生产实践中的广泛应用。石杉碱甲可以与BxACE1稳定结合，鉴定表明石杉碱甲可以提高苦参碱的杀虫效果，具有生防药剂辅剂的开发潜力，可替代基因沉默技术实现抑制BxACE1的目的。因此，通过乙酰胆碱酯酶抑制剂石杉碱甲可阻断BxACE1的功

4、能，进而达到提高苦参碱等植物源药剂杀虫效果的目的。ACEIs通过抑制线虫体内的乙酰胆碱酯酶的活性，使线虫体内的胆碱水平短时间内大量提高，从而导致其中毒死亡。该类具有代表性的杀虫剂是有机磷类化合物和氨基甲酸酯类化合物，大多为非可逆型ACEIs。石杉碱甲是来源于石杉科植物蛇足石杉的一种半萜生物碱，是一种高效、高选择性、可逆性的ACEIs。本研究将石杉碱甲引入松材线虫研究，是对该植物源药剂的一个新尝试。关键词：松材线虫；乙酰胆碱酯酶；石杉碱甲；抑制剂；苦参碱；RNA干扰中图分类号：$432．1文献标识码：A文章编号：1001—7488(2015)01—0066—08Bx

5、ACE1GeneRNAiandProteinInhibitionofAcetylchOlinesteraseinPineWoodNematodeBursaphelenchusxylophilusLiuLihongWangFengMaLingWangBuyongChenQiaoliLiuXiaohanDongWanyingXueYi(NortheastForestryUniversityHarbin150040)Abstract：【Objective】Bursaphelenchusxylophilus(nematode)，thecausativeagentofpin

6、ewiltdisease，hasdevastatedpineforestsforalongtime．Asafeandeficienttechniqueisneededurgentlytocontrolthenematodeandpreventthepinewiltdisease．Thepreviousstudiesindicatedthatthematrineisnotsuitableforpreventingthepinewiltdiseasealthoughitisanenvironmental1yfriendlybiocontrolagent．Todevel

7、oplowtoxicityandeffecientnematicides，thegene，functionandproteininhibitionofacetylch0linesterase1inpinewoodnematodeB．xylophilus，wasstudied．【Method】TheB．xy，hiluspopulationsusedinthisstudywerecollectedfromGuangdongProvincein2007．Thehostismassonpine(Pinusmassoniana)．Thenematodesweresepara

8、tedby