交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究

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1、分类号密级蔺,大拿研究生学位论文论文题目中文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究论文题目外文"研究生姓名张璐学科、专业生物学生物化学与分子生物学研究方向·植物分子生物学学位级别博士导师姓名、职称」李红玉教授论文工作起止年月,…年月至年月论文提交日期介年月论文答辩日期年月学位授予日期校址甘肃省兰州市n原创性声明本人郑重声明本人所提交的学位论文,是在导师的指导下独立进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等,均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外,不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究

2、成果做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名旅污路日期刀、`、关于学位论文使用授权的声明本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品,知识产权归属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定,同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版,允许论文被查阅和借阅本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时,第一署名单位仍然为兰州大学。保密论文在解密后应遵守此规

3、定。论文作者签名卫当蹂一导师签名机日期n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究目录缩略词表……,……,……,,…中文摘要……,,……关键词…………,……众……,……第一部分前言综述……植物的交替氧化酶……交替氧化酶基因的转录调控……交替氧化酶的结构及活性的调节……交替氧化酶在植物抗逆机制中的作用……低温,高盐等逆境胁迫……,……,……超敏反应和细胞程序性死亡……机械损伤和氰化物……交替氧化酶与植物防御系统的关系……植物对抗昆虫的防御体系……,……植物对昆虫取食的感知……植物抗虫信号的传递……植物抗虫的直接防御反应和间接防御应……,……,

4、一,…,植物对抗病原菌的防御体系……,……植物对病原菌的感知……,……,……植物抗病反应的信号传递机制以及系统获得性抗性……,……植物抗病反应信号途径之间的“,,……课题的提出……,……第二部分交替氧化酶在烟草针对咀嚼式昆虫烟草天蛾幼虫防御机制中功能的研究……材料和方法……植物材料的培养……,……,……、……烟草交替氧化酶基因沉默的转基因植株的构建和鉴定……模拟虫咬诱导处理……烟草天蛾幼虫虫咬处理……提取和基因转录水平的荧光定量测定……烟草叶片中植物激素的测定……烟草叶片中次生代谢产物的测定,……,……,……烟草天蛾幼虫虫咬实验……实验结果与分析……,……烟草同源基

5、因的蛋白序列比对……烟草转基因沉默载体图和对基因拷贝数的鉴定……模拟虫咬诱导处理后烟草基因的转录水平……烟草天蛾幼虫虫咬后烟草基因的转录水平……转基因烟草中基因的沉默效率……模拟虫咬诱导处理后烟草叶片中植物激素的水平……,…烟草天蛾幼虫虫咬后烟草叶片中植物激素的水平……n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研究烟草天蛾幼虫虫咬后烟草叶片中防御性次生代谢产物的水平……烟草天蛾幼虫虫咬实验·································……讨论……,……第三部分交替氧化酶在烟草针对刺吸式昆虫小绿叶蝉防御机制中功能的研究……材

6、料和方法……,……,……植物材料的培养……,··························……烟草与小绿叶蝉互作的温室和野外实验……,……提取和基因转录水平的荧光定量测定……烟草叶片中植物激素的测定·····················································,······……烟草叶片中次生代谢产物的测定……其它转基因烟草与小绿叶蝉的互作实验……实验结果与分析……,·……小绿叶蝉的侵染对烟草叶片造成的损害……,……小绿叶蝉侵染后烟草基因的转录水平……,……小绿叶蝉侵染后烟草叶片中植物激素的水平……小绿叶蝉侵染后烟草叶

7、片中防御性次生代谢产物的水平……,戈即,内,等转基因烟草与小绿叶蝉的互作实验……讨论……,一…,……,……,……,……第四部分交替氧化酶在烟草针对番茄非致病型丁香假单胞杆菌防御机制中功能的研究……材料和方法……,……植物材料的培养……,···············……烟草与番茄非致病型丁香假单胞杆菌的互作实验……,……烟草细胞坏死的卿染色和离子渗漏的测定……,二,……,……提取以及基因转录水平的荧光定量测定……,……烟草叶片中植物激素的测定·,········,··············,···························……烟草叶片中过氧化

8、氢的染色和试剂盒测定……烟草叶片中次生代谢产物的测定,……,……实验结果与分析···········……番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染对烟草叶片的损害……番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染烟草后叶片的细胞坏死……番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染烟草后基因的转录水平……烟草叶片中番茄非致病型丁香假单胞杆菌菌落生长的生物学检验……番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染烟草后叶片中过氧化氢的水平……番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染烟草后植物激素和公叭基因转录的测定……番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染烟草后叶片中植物次生代谢产物的水平……讨论……,,……第五部分结论……参考文献……,……附录

9、……,……,……,…,,……,……“……,`致谢……研究成果……n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和杭病机制中功能的研究图交替氧化酶在线粒体电子传递链中的位置……,……图交替氧化酶蛋白序列的推断比对……图交替氧化酶的结构……,…图昆虫唾液中的刺激因子……,…巧图植物昆虫互作信号机制模型……图茉莉酸生物合成途径和茉莉酸的活性衍生物……图植物抗病机制进化模型……图植物防御机制相关的激素信号网络……,……图蛋白质序列和同源蛋白质的比对……、……图转化载体图和酶切鉴定基因拷贝数……图烟草基因转录对模拟虫咬处理的响应……图烟草基因转录对真实虫咬的响应……图气转基

10、因烟草中基因的沉默效率……图野生型和转基因烟草模拟虫咬诱导后的激素水平……图野生型和让转基因烟草真实虫咬诱导后的激素水平……,……图野生型和转基因烟草真实虫咬诱导后次生代谢产物的水平……图野生型和转基因烟草虫咬实验……,……图小绿叶蝉对烟草叶片的损害……图烟草基因转录对小绿叶蝉虫咬的响应……图野生型和让转基因烟草在小绿叶蝉侵染后的激素水平……图野生型和扮转基因烟草在小绿叶蝉侵染后次生代谢产物的水平……图小绿叶蝉对江、心、、等转基因烟草的侵害……,图番茄非致病型丁香假单胞杆菌对烟草叶片的侵害……图番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染烟草后叶片的细胞坏死……图烟草基因转录对番

11、茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染的响应……,……图番茄非致病型丁香假单胞杆菌在野生型和烟草叶片中的生长……图番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染烟草后叶片中的过氧化氢水平……图番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染烟草后的激素水平……图烟草基因转录对番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染的响应……图番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染烟草后次生代谢产物的水平……图在植物针对咀嚼式昆虫、刺吸式昆虫和病原菌的防御机制中的角色……n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究缩略词表缩略词英文名称中文名称交替氧化酶嗯川阴洲妊吠州`泛酮水杨酸们茉莉酸乙烯,`茉莉酸异亮氨酸结合物邓超

12、敏反应细胞程序性死亡菌落形成单位。叮超敏反应细胞程序性死亡儿细胞有丝分裂原蛋白激酶水杨酸诱导蛋白激酶兀伤诱导蛋白激酶活性氧病原菌相关的分子识别模式印儿受体类似蛋白激酶形核昔酸结合位点亮氨酸重复卫水杨基氧肠酸n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研究中文摘要交替氧化酶是植物线粒体呼吸电子传递链的重要组成部分。区别与细胞色素呼吸主路径,交替氧化酶调节的线粒体呼吸电子传递链分支于泛酮处并具有抗氰化物抑制的特性,因此也被称作“抗氰交替呼吸途径”。在关于交替氧化酶生物学功能的研究中发现,它参与到了植物抗低温、抗旱、抗盐、抗氧化等一系列的机制当中,并

13、且对维持植物线粒体氧化还原平衡状态起到重要作用。由于交替氧化酶这些重要的生物学功能,关于它的研究一直是植物学研究领域的热点。本研究通过构建烟草交替氧化酶基因沉默的转基因植株乙,立足于烟草和咀嚼式昆虫烟草天蛾、烟草和刺吸式昆虫小绿叶蝉、烟草和病原菌番茄非致病型丁香假单胞杆菌三个不同的互作体系来对交替氧化酶在植物抗病虫害机制中的作用进行了深入的阐述。通过研究发现,烟草基因的转录受烟草天蛾幼虫取食的强烈诱导,但是该基因的沉默并没有影响到烟草抗虫反应相关的信号激素茉莉酸的积累,以及下游抗虫性质次生代谢产物的生成,因此没有改变烟草防御烟草天蛾幼虫的能力。但在野外试验和温室试验

14、中,我们发现相对于野生型烟草,烟草更容易被一种刺吸式昆虫小绿叶蝉侵害,并被诱导积累了较高水平的水杨酸。而在烟草被侵染后,茉莉酸调节的下游防御性次生代谢产物也显著减少,表明烟草中较高的水杨酸水平抑制了茉莉酸信号途径调节的抗虫防御反应。分析这很有可能是由于小绿叶蝉这类刺吸式昆虫在取食植物的同时也能带给植物病原菌的侵染,进而诱发植物依赖于水杨酸的抗病反应。通过以上两部分研究也证明了基因在参与植物抗虫防御时的不同角色。在关于烟草与番茄非致病型丁香假单胞杆菌互作体系的研究中发现,相对于野生型烟草,烟草在受病原菌侵染后细胞程序性死亡加速,并伴随有较高水平的水杨酸和过氧化氢的积累

15、,而且在烟草中病原菌的菌落生长数量也有所下降。分析交替氧化酶可能是通过抑制叶片内过氧化氢的生成来调控细胞的程序性死亡,从而间接影响了烟草的抗病能力。论文从三方面系统地阐述了交替氧化酶在植物抗虫,抗病机制中的作用,并且加深了人们对交替氧化酶生物学功能的认识。关键词交替氧化酶,植物免疫,茉莉酸,水杨酸,细胞程序性死亡n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研究,一即,枷“一",,,,,,田力,一以以丫`田盯承白,娜妙八侧拟一,,一七"刀,一力少二一冲一二一,一,邓耐,,不,一,,n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭

16、虫和抗病机制中功能的研究冰,n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究第一部分前言综述植物由于其终身附着于地面生长的特点,经过长期的进化形成了一套独特的防御机制来应对各种昆虫和病原菌的侵害,以及周围环境剧烈变化所造成的危害。通常外界的刺激会诱导植物自身一系列防御反应的启动。首先,植物通过专一性的受体对不同的刺激信号进行识别,而后再将信息经过一个复杂的植物激素网络传递给细胞核,最终通过相应的转录因子直接或者间接的指导相关基因的表达而做出回应。显然经历这样一个复杂的过程,会引起植物自身生理生化水平的改变,而线粒体作为植物细胞内生长代谢的重要细

17、胞器,为植物细胞维持正常的生理状态提供了和生物合成所需的底物,并在植物应对逆境过程中起到了关键作用,,。植物的线粒体比较特殊的是具有一条对氰化物耐受的呼吸途径,尽管对这条路径的生物学功能至今仍不是十分清楚,但是人们发现,当植物在经受生物胁迫或非生物胁迫时都会伴随着该呼吸途径的升高,而该呼吸途径中唯一的调控酶一交替氧化酶也同样被诱导表达,,这表明了交替氧化酶在植物对抗逆境机制中可能的作用。后续的研究也逐渐发现该基因的转录调控与水杨酸、乙烯、一氧化氮等植物激素十分相关,,。,,同时这些激素也是植物抗病虫害机制中用来调控防御反应实施的重要信号分子。这无疑成为我们研究交替氧

18、化酶在植物抗病虫害机制中作用的契机。植物的交替氧化酶植物的交替氧化酶位于线粒体的内膜上。,,它属于线粒体呼吸电子传递链的一部分,能够“选择性”的将部分电子从泛醒传向氧而催化生成水,图。不同于细胞色素氧化酶,在传递电子的过程中没有形成跨膜的质子动式,因而反应没有的产生,能量最终以热的方式分散,,。同时,由于该路径绕过了细胞色素主路径,而使其具有了对氰化物的抗性,因此这条呼吸路径也被人们称为抗氰交替呼吸路径了明界,。交替氧化酶基因的转录调控关于基因的分布,最早人们普遍认为它只存在于植物,真菌和一些原生质体中,不过从和年报道了第一个原核生物的基因后,陆续的研究表明其实广泛

19、的存在于,除了古细菌外几乎所有的生物物种中、乞雌勇,。年在一次对出名海水中微生物的基因组侧序的实验中,n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究、乞和他的同事发现种不同的基因,这已经是当时数据库中关于基因数目的两倍了,显然这为人们提供了发现新的同源基因的思路,。在很多真核生物中也发现基因的存在,如变形虫、真菌等等仙。,现,。最近人们还惊奇的发现,基因也存在于动物当中并且广泛分布于多种动物,隶属于个不同的门脊索动物门、半索动物门、棘皮动物门、线虫动物门、软体动物门、环节动物门、腔肠动物门、海绵动物门,。相信随着更多的基因组测序的完成和数据的

20、公开,基因的分布将更为广泛。图交替氧化酶在线粒体电子传递链中的位置,。复合体一是脱氢酶复合体二是唬拍酸脱氢酶复合体三是细胞色素复合体复合体三是细胞色素。复合体四能够被氰化物,一氧化氮,叠氮化钠,硫等阻断。蛋白则不会被此类物质抑制,专一性抑制酶活性的是水杨基轻肪酸和五倍子酸丙酷。硒。力,,,,,,一,,面,,困,,,币在植物中则分布于几乎所有的陆生植物,在遍布于个不同的门近种开花植物中人们对的活性和基因做过研究报道。不过出于对农业生产的考虑,大部分研究对象都集中在单子叶和双子叶植物,人们对不开花植物中的作用知之甚少。n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗

21、病机制中功能的研究工目陀杖认”肋行口卜几月目脚口自公欣”滚盆,峨翻蕊口称叭作曰品几月闷肠附目以吕每困旧曰六,刊吸一︸一︸一︸﹃一︸︸月`……`…奋…`二,辛介,“今一争卜,。。。,,例日皿护创姗剐诀护民们灿函翻山几翻人洲滋阳枯梦二、,,加洲翻份砚侧献打璐乙,民`叼护们曰限口`几藻裳攫磁薰撰一薰︸一矍︸︸﹄︸锄彻奋封月匀资匀口杏,,。,门幻分晚峨灿目书脚幼几盆口公姆甘以麟吐盆。,,,。侧目洲脚川侧取刀日浪月成如脱劝国吸丫,,时卜冲田口儿一炒一一乙目丹门气口工口和目妞叹湘以既二翻址翻沈日决几幼州洲乌幽岁翻夕心用】以琪一翼一一,︸,。。。,,,,,佣叹乍口,旧侧限山、」,

22、︸尹口﹂叭曰叭﹂别洲梦切引咋月,日幻丹目劫口翻兮,眺,了卜丫扣山乙吕了甘甘目呢附湘协找匆目洲行日翻丫`获岛幻戈勺,口犷几甲洲目目沁阳目口日肺护…皿翻哪牌下乙别曰,比即月目朋伙工了团困她退叨丫双肠公盆`二勺汉幻服口钾砚工压蕊刀口口,砚劝刀乙昌工匆口日节旧那肠残了砚胭以拟翔川卜执石```切拍翻目刃即砚,宫匆口比透脚丫创叨吕从欲翰份训陀盆儿目山以欲,勺傲器乙跳加护勺盆。月例目口烟了了曰月滚翻切,例国了肠李艺民份公扣曰洲口匀甘丫日幻困幻口目曰吸护—”冲,,,功。峨—汉月刀口其护阳解严和琳。翻日乙工皿甲瓦舰幻口川略乙丁卜阳曰肠刊悦公旧月目了口翻`之`。日民及翻洲乙甘了及肠朋别

23、舜亡欲月乙翻沈门沈口巨一洲叫比决翻阅习叮叮由卜欢舀乙砚及阅`互翻目目口,月口认赞切从理梦皿目,日臼口侧目口傲目扛州口万侧旧、之汤翻峨玉公幻目以汾例翔欺召甘坎们川日奋`忿日九皿洲皿侧成峨`阅牙护翻、氏扣曰伪罗幻口以留州冲皿拐冲仙净启日叹月月翻珍皿翻翻民翻仕翻困习比盆翻洲翻幻附跳翻丫口睁乙狱口`侧目拍``忿启翻月翻忿川助翻洲厅洲月吸乙乒决翻圈乙皿公梦蕊品解刀口封伪派于甘洲』西盆皿盆月翻名川口扛洲口获目、魔梦,乙启日盆扁口附创,蕊翻罗二月城忆乙月口兮加翻闭月盆``兮珍洲峨川里翻目牙二匕叹岁公口月岔日日肚皿孟岔,称吸、待`肠硬矛一翻`月肠即,尸峪示诵肠口闭除口山与甘尼剐助抽

24、蕊抽舰州了日泣︸一︸一︸”二目仙去,卜班一︸︸一"﹄﹃︸﹃曰碑扣阴刃幻城洲汗即翔滋蕊一︸﹄油嘴翻,创肠盛划以幻拍日妞口找泊解切摊以习山”班找护口份抓址从“勿冲和目月针峨别即日甘愉阅以凌到目比丫均羊口姚知从工拟节礴场洲巾口煞吸翻习边”筋匕例冲阅叹士乙场几郎讥介恤目叭旧甲日比心工砚昭皿砚月肠甲翻芍旧幽,民胶了了目,了”拍中明了国到叭嗯甲幻改山工跳,研日咨皿吕周沁抓们,日绍心介份翻峨跳明刀陷助国笼甲旧训叮吸梦畜助几吠了心了扮翻叭旅翻比日一︸·琴`。。,····,,·几甲娜勺以为`娜附”···一甲扣闰试月拙加工哪,`…甲呷哪哟乡竺竺乡叫叭···,二甲工侧茅阳肠城理

25、涌卫跳晰叭··,·,,甲用,旗姐曰田姗`,娜··,,,·滋甲卿哪甲些竺竺招华·····一几娜翔用哪汤欣宝,,瓦的试”,``,、“翻盯`…加盆口匀月肠甘日丫口目峨暇公呀月扣不,,甲,,,,,,`岛湘乙,,二叨狱盯】即冲到叹苏丫口洲陌闪挂留创目比洲节厅自飞目咬栩附翻睁日乙,乞扣睡日鱼行截叭和瓦七护朋减挤砚侧翔图交替氧化酶蛋白序列的推断比对。序列来自七种不同植物烟草、马铃薯、拟南芥、大豆、芒果、枯苞和三种原生物链抱霉、异常汉逊酵母、布氏罗得西亚锥虫。在马铃薯和枯苞中交替氧化酶第一个甘氨酸残基己经测出并用方框标出。在植物或非植物物种较为保守的半胧氨酸残基用注释。而,,代表了

26、枯苞的】基因的三个内含子序列。而可能参与铁离子结合的螺旋结构分别由和,,,,表示、恤吵,。,七刀。几,,,,,即肋加,,,卿,,权甘n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究。,,,皿,万一,滋议,,,。,一、乞吵,植物中基因由细胞核编码,在拟南芥、烟草、小麦、棉花、水稻等许多植物中都以多基因家族的形式出现认飞,,,于公卫,,,。在被子植物里,有两个同源基因和,其中广泛分布,只是在有限的几个双子叶植物中存在,。尽管各同源基因的功能还需验证,但是普遍认为很多基因是属于持家基因,而部分确实受逆境胁迫的诱导。由于蛋白在植物细胞呼吸过程中行使的重

27、要功能,它的表达则受到植物的精密调控。蛋白定位在线粒体膜上,因此线粒体的代谢状态也能调控的基因表达,这种特殊的线粒体调节一个核基因的表达的现象也引发了人们对相关信号途径的研究,发展出线粒体倒置的学说助,。比较普遍的是关于逆境下烟草和大豆中基因能够被诱导表达的研究,并且发现三梭酸循环的中间产物,柠檬酸、苹果酸、酮戊二酸的水平都能够影响的转录水平、乞川琏少,,,。除此之外,呼吸链各部份的抑制剂同样能诱导的表达,比如抗菌素和氰化钾等、恤琏勇,勾,。,。与活性氧爆发相关的物质也能刺激基因的表达,在拟南芥的悬浮细胞系中活性氧的生成促进了的表达,并且同时抑制了的表达。,,相同的

28、结果也被证明在烟草和玉米中存在、乞雌勇恤。咖,。,。植物激素水杨酸也是匕较早证实与基因转录相关的,在番茄中甲基化的水杨酸作为一种系统信号也能促进的基因表达。,。乙烯、茉莉酸也被证明促进一在烟草中的表达。,。其它相关的研究发现,很多逆境条件都调节了基因的表达,如臭氧、盐胁迫、紫外线、温度等等,,。尽管人们已经知道了很多因素能够影响基因的表达,但是其中的调控机制却不是很清楚。对植物和真菌中基因的顺式反式作用元件、启动子的研究也正在进行,有趣的是发现的启动子序列与蛋白家族的十分相似,而该基因参与到了n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究植物

29、的抗病反应中,。对大豆、叉序列启动子区域的分析显示其位于翻译起始密码子上游处,并且发现还有其它的作用元件位于基因的"端。在与拟南芥基因启动子序列的对比后发现,在大豆中还包含很多个共用结构域,它们被证明与植物的发育、组织特异性和对环境的响应有着重要关系拈厄,。而相关调控的转录因子的研究,最新的进展是在对真菌基因的研究,发现在链抱霉中基因的转录需要、、、、五个基因的协同参与。,。交替氧化酶的结构及活性的调节、州翻曰嵘抽妇曰封口肠名想徽,,扭刀杨妾竹到脚,犯图交替氧化酶的结构提出的模型川提出的模型。推测的螺旋区域用圆柱表示,椭圆形部份是蛋白端或端的。奴江如如五一

30、叨一印由于能够催化氧气生成水的反应,对该蛋白活性中心的结构域的研究推测其结合了两个铁离子,并且带有四个跨膜的螺旋结构能够很好的与氧气结合,。在提出的结构中图他推测跨膜的螺旋结构带有的两个一一一结构一一一犯一正好与两个铁离子进行配位形成一个典型的双铁梭基蛋白的结构,。而随后,由于掌握了更多的序列的信息,刀又对蛋白结构进行了修正,同样是两对反向的平行n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究螺旋机构形成了一个四螺旋的结构域,但是要比先前的长很多。而且他们推测蛋白并不是一个跨膜的结构而是由两个亲水的螺旋结构插入到线粒体内膜图,而与铁离子形成配位

31、的是一一一,一一一这两个结构域,。关于基因研究的一个重要方面就是关于线粒体代谢水平对蛋白酶活性的研究。因为从生理功能上来讲,线粒体呼吸代谢跟在电子传递链中的作用直接相关。在植物中蛋白通常是以共价二聚体的形式存在的,两个结构类似但可能受不同基因编码的单体通过二硫键连接而成,。从基因的过表达植株中分离出的线粒体,发现蛋白存在两种形式氧化态或者还原态的二聚体、乞,通过还原和非还原的一分离出烟草的蛋白二聚体为,单体为。并且通过二硫键结合的二聚体比具有琉基的还原态活性要弱,。因此人们推测蛋白的活性是通过自身琉基二硫键的转换来实现的,对蛋白端的亲水区的两个半肤氨酸残基的点突变研

32、究发现,是它们起到这种调节作用灿。。,、乞。。,。的还原也同时能够被线粒体的代谢状态快速调节,比如柠檬酸、异柠檬酸、苹果酸的体内代谢、恤。。,。在对过表达异柠檬酸脱氢酶的转基因烟草的研究中发现的被激活为还原态,并且对植物添加柠檬酸能使蛋白活性显著提升。,。这表明的活性调节依赖于,并可能被一种硫氧还原蛋白或者谷肤甘肤体系调节。除此之外,在被子植物线粒体中蛋白活性也被丙酮酸调节,早期的研究推测丙酮酸可能与的半耽氨酸残基形成一个硫代半缩醛来调节酶活性,。交替氧化酶在植物抗逆机制中的作用关于交替氧化酶生理功能的研究,最早开始于对天南星科植物开花过程中放热机理的研究,”叮一,

33、。基于这个发现,生理功能的研究一直侧重于它的放热机制,如在低温处理的条件下马铃薯块茎放热的现象受调节。。,。。,。随着研究的深入,发现放热现象并没有在植物中普遍存在,而恰恰是功能很特殊的一个例子。因为生理结构上的屏障,很难有植物会像天南星科植物那样具有庞大致密,饱含有丰富线粒体的组织来维持热量产生。其次,单从化学反应产能的方面考虑,交替呼吸途径与主细胞色素途径产热没有很大差别。并且一般植物的组织结构和导热性,用线粒体呼吸代谢速率所产生的热,很难加热它们乙,。对于的生理功能现在比较广泛接受的观点是,它的功能是调节线粒体呼吸过程n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟

34、草杭虫和抗病机制中功能的研究中,泛酮库的稳定状态。当呼吸代谢的底物消耗超过了产生的需求,则大量的还原势能以电子的形势涌入电子传递链,这会使泛醒库处于一种过还原的状态,从而产生超氧阴离子,并进一步被超氧化物歧化酶转变成过氧化氢,。过氧化氢则对线粒体产生很大的危害,诸如阻止酶的反应、损毁、氧化线粒体膜造成膜的缺失,。而的作用就是消耗过量的电子,来阻止过氧化氢的产生。依据是,在向植物细胞悬浮系里加入过氧化氢时蛋白会大量表达,、乞,。更为直接的实验证据是对于线粒体泛醒的还原状态的测量,当改变细胞色素的主路径的时候,变化的很小但是如果抑制交替途径,就会变为过还原态。,。由于这

35、种调节线粒体活性氧生成的功能,一系列与氧化胁迫相关的抗逆机制的研究也相继展开,如机械损伤,、氧胁迫丫、干旱何军贤等,、低温,、乞,一,以及病害侵染,一李红玉等,等。低温,高盐等逆境胁迫事实上最早关于能够减少线粒体活性氧的理论,是在对植物抗低温胁迫机理的研究中提出来的,,例如在低温处理的玉米幼苗中,过氧化氢的产生就大部分来自线粒体。,,而低温对细胞色素途径的抑制作用要大于对交替途径的抑制,。无论是在转录水平还是在蛋白水平都在低温处理后明显上调。,、乞恤,。。,千公卫。,。这些大量的实验证据表明,参与到了植物抗低温的机制中,但是始终未能解释其确切的机理。这主要是由于整个

36、线粒体电子传递链在面对低温胁迫时,很有可能是共同参与相互影响,低温下的玉米和西红柿自身的细胞色素呼吸途径就有增加。。,即价。。,,并且低温对线粒体的唬拍酸脱氢酶和脱氢酶都会产生影响,从而影响了泛醒库。,。因此,需要更多的线粒体呼吸链蛋白缺失突变体,结合代谢组学的研究来阐述在植物低温逆境下的功育旨。除了低温胁迫,事实上其它理论上能引起线粒体活性氧爆发的逆境胁迫都能诱导的活性,比如盐胁迫,它被证明能使植物原生质体的活性氧水平升高。,在大豆中,当根部处于高盐浓度环境时表达将升高,。在拟南芥的转录组的研究中发现,基因是高盐处理过后显著上调的众多基因中的一个冷,,这些发现暗示

37、可能也参与了植物抗盐胁迫的过程。超敏反应和细胞程序性死亡n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和杭病机制中功能的研究另一个与活性氧相关,并且也被推测参与其中的就是植物细胞程序性死亡以及相关的抗病原菌的机制。作为最普遍的一种活性氧,被认为是调节细胞程序性死亡的一个重要因素,对植物添加外源的过氧化氢最终会导致植物的细胞程序性死亡一,。,叭硕。,。同时,植物自发的程序性死亡以及被病原菌诱导的细胞死亡的过程中都发现了活性氧爆发的现象。线粒体活性氧的生成,细胞色素的渗漏甚至是的减少,这些与都紧密相关,都能在这些条件下被诱导表达。和、乞年的研究指出,在对基因沉默后植物

38、细胞变得更容易受诱导而进入过程。相反,野生型的细胞系则不被诱导,并且这些诱发试剂都使细胞产生了大量的蛋白。因此,很有可能在发生的初期减缓了反应的发生,作为一种缓冲机制来保护细胞。这一点在烟草病毒诱导的超敏反应中得以证实。,。植物的是植物抗病机制的一个重要部份,作为超敏反应的特征,它可以有效的限制病原菌的繁殖。在这个过程中也伴随着活性氧的爆发,和水平的升高,两者都被证明能够诱导的活性。在拟南芥的细胞系超敏反应中基因也被诱导表达。,。所有的实验证据都描述了在植物抗病的超敏反应中有一定功能,但是深入的机理研究却不多,主要集中在烟草对的抗性研究。用这种化学抑制剂处理叶片能够

39、抑制诱导的抗性。,而后续的遗传学实验,运用的过表达突变体和沉默突变体却并没有发现烟草对的抗性增加或者减弱,但是细胞坏死的面积确有不相同,。因此,很有可能并没有直接参与到植物抗病机制当中,而是通过改变线粒体氧化还原平衡来缓解细胞程序性死亡的过程。机械损伤和氰化物植物柔软的组织在自然界中是十分容易受到损伤的,通常在损伤的部位检测到伴随有活性氧的爆发。,。在植物机械损伤过程中的研究最为典型的例子是关于马铃薯的工作,在切下的块茎中交替途径活性逐渐升高,用单克隆抗体的实验发现损伤刺激了蛋白在土豆块茎中的表达。,而关于在机械损伤中的作用,却没有更进一步的研究来说明,比较一致的观

40、点还是认为它能缓解损伤对植物组织带来的活性氧爆发。植物不通于动物的一个特点,就在于能抗氰化物抑制来维持呼吸,则是这个过程的重要蛋白。的活性通常由于植物组织内部的生氰反应而调控升高,例如乙烯的生物合成过程中的副产物就是氰化物,而这一过程于植物果实的成熟息息相关。因此,调n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和杭病机制中功能的研究节的抗氰呼吸被证明也参与到了植物果实成熟过程中一,,,而乙烯也被证明能诱导马铃薯和番茄的活性从,,。而位于线粒体的一氰丙氨酸合成酶的一个主要功能就是对氰化物解毒,并维持其在较低水平。,。植物中还存在以一类生氰糖营,由一些氨基酸经糖营酶

41、水解后和游离的氰根例子结合而成,被证明在植物与真菌或者昆虫的互作过程中起到防御作用,,,很有可能在这种生氰过程中维持了植物正常呼吸。交替氧化酶与植物防御系统的关系昆虫和病菌的侵害作为常见的生物胁迫,影响了植物的生理生化水平。而长期进化过程中,植物也能通过一系列复杂的信号机制来调控自身的抗虫抗病反应,抵御这种侵害,并且还需要在生长发育和防御之间做出一个策略上的选择。一方面要维持体内正常的物质代谢另一方面要合成与防御相关代谢产物。线粒体作为植物细胞重要的产能器官,它调节的呼吸代谢,不仅提供了植物生长所需的,而相关的中间产物和初级代谢产物为植物合成各种重要物质提供了原料,

42、线粒体与植物的生长发育息息相关。而在植物调节防御的信号网络中,很多信号也能够同时调节线粒体的呼吸,比如,和,,、乞,。这些信号分子能够抑制或者损坏线粒体细胞色素呼吸途径,使抗氰呼吸途径的活性增大并且调节途径末端的交替氧化酶的表达。此外,很多植物产生的防御性的产物本身对植物也是有毒的,例如生氰糖营这类物质平常会以一种无毒的结合态储存起来,到受侵害后诱导释放,所释放的氰根离子是电子呼吸传递链的抑制剂,这时候植物自身交替氧化酶调节的抗氰呼吸途径的作用就显得格外重要了。植物对抗昆虫的防御体系植物在数百万年长期进化的过程中,由于不断受到昆虫的取食逐渐演化出了一整套复杂的防御体

43、系。当昆虫侵害植物后,植物自身能够重新调整体内代谢来产生防御相关的次生代谢产物,如蛋白酶抑制剂、生物碱、生氰糖普、芥子油贰、酚类化合物等等。这些代谢产物不但能起到驱赶、毒杀活着减弱昆虫消化能力的作用,而且其中一些易挥发的物质能够被用来吸引害虫的天敌,或者作为预警信号传递出去,。显然从对昆虫取食的刺激信号的感受,到信号的传递放大及最后调节防御性蛋白或者次生代谢产物的合成,这样的一整套防御体系是被一个精细的信号网络所调控的。植物对昆虫取食的感知昆虫对植物取食所造成的损伤和普通的机械性损伤都对植物造成了刺激,但是植物却n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和杭病

44、机制中功能的研究能区分出两者的不同而作出不同的反应,,漱。,,。人们对于这个识别机制的理解十分有限,现在普遍公认的两个观点是一是昆虫唾液中含有一种特殊的化合物,能够刺激植物的防御反应二是昆虫特殊的取食方式,特别是咀嚼式的进食方式,能够不断对植物产生刺激,从而通过未知的信号传递方式使植物辨别出来。从昆虫唾液中分离得到的一类脂肪酸氨基酸聚合物图,因为它能够刺激植物产生与虫咬相似的防御反应,而被作为昆虫唾液刺激因子而广泛研究。图就是第一个从甜菜夜蛾的唾液中分离出来的化合物刺激因子,因为它能够刺激玉米幼苗产生抗虫性质的挥发物。后来作为刺激因子,在鳞翅目昆虫与植物互作体系中被

45、广泛研究,,,,,。由于这类化合物能选择性的结合到植物细胞质膜上,证明了可能在植物细胞膜上存在有它的受体。当然也有部份植物,例如棉花就对没有任何反应,,但是在虫咬后仍然能释放出特殊的挥发物,这证明还存在有其它的束」激因子。在斑豆吻儿与草地贪夜蛾口咖尸心的互作体系中,从唾液中分离出一类带有二硫键的端肤图,同样能够刺激植物的乙烯释放、茉莉酸和水杨酸的水平。有趣的是,其实是虫体消化植物叶绿体时,叶绿体内部合成酶的一个一亚基。而仅仅几个的浓度,就能在植物体内诱导出一系列的防御反应,。同时,节肢动物的唾液也被证明有的存在,北美蝗虫唾液含有一种叫做图的脂肪酸,被证明能够刺激小麦

46、幼苗的菇类化合物的释放,。当然除了昆虫的唾液被证明含有刺激因子外,一些昆虫产卵的时候所分泌的液体,如图,就是在豌豆象口产卵时分泌的。可以刺激植物释放挥发物从而来吸引捕食者来吃虫卵,,,,。n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研究厂上、关从卜、、奋产、勺尸衬”竹舫犯谁,林,·盆汗叮屯·煞叹洲内、、夕犯地一细一伪压一一吞丫。价、日"一“比`“丫"“扮一一伪一白一彻一卜鑫图昆虫唾液中的刺激因子。一不同的昆虫由于取食的方式不同,同样也能对植物造成特有的刺激。这方面的研究比较有趣,和他的同事用一种机械毛虫,不断的“进食”利马豆

47、的叶片,来模拟虫咬的方式,发现同样能刺激出与真实昆虫侵食相同的挥发产物的释放,证明部份植物能够识别到昆虫啃食叶片时不断的刺激,进而启动自己的防御机制,。。植物抗虫信号的传递尽管人们对植物是如何感受昆虫侵食的还不甚了解,但是得利于丰富的突变体资源,人们对下游的植物抗虫信号的传递和响应的了解已经比较深入了,特别是以茉莉酸为主的信号通路。当然,除此之外,离子浓度变化、细胞膜去极化、以及有丝分裂源蛋白激酶的级联放大,还有活性氧、一氧化氮这些小分子信号物质都被证明与植物抗虫信号的层层传递相关图。细胞膜的去极化是植物细胞对昆虫侵害的反应之一,等人测定被口丈人$,"&q

48、uot;幼虫侵食后的利马豆叶片的细胞膜极性的变化,发现在虫咬后短短的几分钟内,就观察到了细胞膜去极化,并且发现,距离虫咬较远的部份,有着孑然不同的变化,。这种细胞膜极性的变化,对于细胞的生理水平影响是巨大的,直接导致的一个结果就是大量的扩会涌入细胞内部,并且作为一种信号而诱导,传递后续的反应。这n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和杭病机制中功能的研究种细胞膜去极化的现象,很有可能是由于这种类似表面活性剂的分子,从而造成了细胞膜双层膜结构中的离子通道发生了改变,。另一个被广泛研究的信号途径是有丝分裂原蛋白激酶信号级联放大通路,在真核生物中参与调控了很多细

49、胞水平的信号传递,在植物抗逆机制的信号调控上也有着重要的作用,介,,。,。和他的同事,通过利用沉默两个水杨酸诱导的蛋白激酶伤诱导的蛋白激酶护的转基因烟草突变体证明了,烟草天蛾幼虫的唾液能够刺激这两个激酶的活性,并且在沉默这两个蛋白激酶以后,植物下游的防御反应被大大削弱了,说明了在植物抗虫信号传递过程中的重要作用,而这种作用很有可能是能够直接调节下游基因的转录水平而造成的丸,,,。并且在关于拟南芥中的研究发现整个信号网络远不只这样简单,在的上游还有,作为一种蛋白激酶的激酶来调节的活性,如、乞,,,。这种级联放大的信号传递,是如何实现的特别是植物怎么来有效的避免信号重叠

50、和冗余,都是急待解决的问题。除了下游的转录因子,被证明还能直接与植物激素、或者第二信使类的分子,如活性氧直接作用几。,。在植物抗病的研究中发现,敲除基因能减弱病菌诱导的过氧化氢的表达。人们推测很有可能存在一种反馈机制,也在调节激酶的活性,,租,,。在关于植物抗逆信号的研究里,活性氧由于扮演重要角色而被广泛研究。由于在植物遭受机械损伤后,植物组织能够快速的产生过氧化氢分子。所以,虫咬造成植物叶片过氧化氢的产生的结果也并不惊奇一,。让人比较感兴趣的问题是,这种过氧化氢的释放机理和它的功能。是一个位于细胞膜上的跨膜蛋白,它在植物抗病机制中产生过氧化氢的功能,已经被人们详细

51、研究了一,,,,,,,它是否也参与了抗虫过程的过氧化氢的产生还比较缺乏直接的实验证据。这个跨膜蛋白的内膜部份有一个的手型结构,被证明是钙离子的结合位点,酶活性能直接被钙离子调节,。利用突变体的遗传学实验和一些专一的化学阻断剂的实验,证明了和扩十之间存在着密切的互作关系,,。,乙,。而且就像前面谈到的一样,蛋白激酶可能也参与其中,在土豆中两个钙依赖的蛋白激酶,被证明能够磷酸化从而产生大量的活性氧。,。关于在植物抗虫机制中作用的研究,还需要n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和杭病机制中功能的研究使用相关基因的突变体来证明。图植物昆虫互作信号机制模型,。一,

52、在植物抗虫机制中处于核心地位的信号途径,应该说是茉莉酸依赖的信号路径了,作为这个领域被最为广泛研究的植物激素,被证明调节参与了几乎所有的抗虫系统,覆盖了鳞翅目、鞘翅目、缨尾目、同翅目、双翅目、半翅目诚,,。同时,关于抗虫实验的基因芯片研究也发现,大多合成路径和信号路径的基因都被诱导了”叮,,丫耐,,。。,耐比一,。而更为关键的是,认其实并不只是简单的参与了防御反应,而是作为一个关键激素在植物面对复杂环境条件下,帮助平衡生长和防御的一种选择,。高等植物中是通过类十八烷烃途径合成的,前体是亚麻酸,在植物收到外界刺激的一个小时之内就会大量积累。关于生物合成通路人们已经十分

53、清楚了,如图。是通过下游的酶转变成为结合态来行使功能的,例如一,就是与异亮氨酸的结合体,被证明直接调控下游的抗虫反应,。除此之外,还有是甲基化的茉莉酸在挥发物中大量存在而调控植物的间接防御机制,。n兰州大学产"兴"二“匕""人小含井撅"讼去的廿肠山`一肠洁“山一`先的研究山解几。,决。心叫卜州卜叫卜口白,心川侈即`睡』,弃丫入一岁产”一人》犷烹扛图茉莉酸生物合成途径和茉莉酸的活性衍生物。曲通过对没有响应的植物突变体的筛选,人们对整个信号通路的机制也进一步加深了了解,口叹口脚只孙扭刀况乙峨叮刀理夕是一个一蛋白它与一泛

54、素连接酶形成了一个复合蛋白结构叫做”,,,盛,。,,它被证明是植物感受的受体,同样敲除这个基因的突变体植物,基本丧失了对昆虫的抗性,,。,,。最近发现的蛋白的降解在这一过程中起到了关键的作用。,。,。首先,厄蛋白作为一个抑制因子结合在转录因子上来抑制下游的防御基因的表达,当植物受到外界刺激时候一的浓度由于的大量生成而升高,从而引导形成了一个一的蛋白复合体通过泛素途径降解,释放上调下游基因的表达。有趣的是整个过程与和的信号途径非常类似,都是通过激素诱导的抑制因子与一个一蛋白和结合后被降解,释放下游的转录因子,,,,。最近研究进展表明,在这一水平,还存在与其它植物激素的

55、互作,如能与乙烯合成的前体结合从而共同调节下游反应,,或者也能直接激活蛋白,激活下游基因转录,。n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究植物抗虫的直接防御反应和间接防御应产生有毒的次生代谢产物是植物最主要的直接防御方式,大多数植物都能持续性的或者诱导的表达一些有毒的化合物,菇类和生物碱就是比较丰富的两类,如烟草等植物叶片受机械伤害或昆虫取食后诱导叶片和根部烟碱的合成。,,根部的烟碱运输到叶片和繁殖器官可阻止昆虫的进一步取食。其它研究的比较多的次生代谢物,就是吠喃香豆素、强心幽、丹宁酸、皂昔类、芥子油昔、生氰糖营类化合物,。虫咬还能刺激植

56、物防御性蛋白的表达,蛋白酶抑制剂就能降低昆虫肠内蛋白酶的活性来影响昆虫的消化。典型的例子就是番茄、马铃薯、大豆等植物受虫害诱导后,能够系统性累积蛋白酶抑制剂来抑制昆虫消化道中的蛋白酶活性,从而减少昆虫的消化能力,。还有些蛋白能够影响昆虫的生理功能,像半肤氨酸蛋白酶可以破坏昆虫围肠膜上的几质结构勘,。,。除此之外,植物表面的生理屏障如分化出坚硬的表皮、香毛簇、荆棘改变自身的营养状况使昆虫不能获得足够的营养也是植物的直接防御。以及最近发现的苏氨酸脱氨酶能够在昆虫的肠道中阻碍氨基酸的吸收,而低含量的氨基酸摄入就限制了昆虫的生长,。这些发现大大拓展了人们的视野,使研究方向不

57、局限于次生代谢产物的研究,而是试图去勾勒出一个蛋白酶抑制剂,氨基酸降解蛋白,次生代谢产物等等共同作用的防御体系。间接性防御是指植物在被昆虫咬食后能释放挥发性物质吸引昆虫天敌,,这种防御体制人们在很多植物种类中都进行了研究,例如基因,就是玉米中的一个菇类化合物产生的基因,能被昆虫诱导并催化产生阁一血,一七。将它们转入拟南芥后,能够吸引海灰翅夜蛾。凌少的天敌缘腹绒茧蜂"。还有利马豆受蜻类取食后释放出菇类和莽草酸途径产生的挥发性化合物,吸引二斑叶瞒的捕食性蜡。,和玉米受甜菜夜蛾幼虫危害后,释放出菇类、叫噪和脂氧合途径的产物,吸引缘腹绒茧蜂“啥动在甜菜夜蛾幼虫体内

58、产卵,导至被寄生的幼虫取食能力显著降低,。受侵害的植物也能够释放自己的来刺激相邻植物的防御反应,三齿篙"就向空中释放来对周围的植物发出预警,。,。,。也有些报道发现菇类化合物,还有的挥发物能够刺激周围植物的防御反应胡。,颇。,勘,,。昆虫取食植物诱导的挥发性化合物,按合成途径分为类第类是绿叶挥发物,主要为来源于脂氧合途径的醇或醛,由亚麻酸和亚油酸氧化生成。第类来源于甲轻戊酸n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究途径和脱氧一一磷酸木酮糖途径。第类来源于莽草酸途径,挥发物的释放是一个被动释放和主动释放相结合的过程,被动释放主要由

59、植食性昆虫取食造成的机械损伤引起,例如来自植物的绿叶性气味,它们是当植物细胞受机械损伤时由质膜上游离的细胞质中的脂肪酸、亚油酸和一亚麻酸经脂氧合酶、过氧化物酶、过氧化物裂解酶等一系列酶促反应形成的,也可以是积累在植物细胞组织或器官中的挥发物,当植物受到机械损伤时直接释放,钦俊德,。主动释放则涉及到植食性昆虫口腔分泌物中刺激因子对植物次生代谢途径以及植物体内复杂的信号传递途径的调控,根据己有的一些研究结果,其可能的释放机制是植食性昆虫取食植物并释放诱导物一诱导物和由诱导物诱发的经韧皮部和木质部传送至整株植物的系统信号物与细胞质膜上的跨膜受体结合,激活一蛋白通过胞内信号

60、传递途径激活脂酶使亚麻酸从膜上游离至细胞质内一经类十八烷信号传递途径,产生茉莉酸茉莉酸与大分子受体结合,促使植物挥发物的系统释放通过植物个体间的化学信使,导致植物挥发物的群体释放“,改,。植物对抗病原菌的防御体系相比植物的抗虫机制人们对植物的抗病机制的了解是十分深入的。这集中体现在对植物识别病原菌和调节下游抗病信号途径的机理研究。简单的说,植物对病原菌的识别可以分为两个不同水平,一个是发生在细胞膜水平的病原菌相关的分子识别模式,比如说对病原菌鞭毛蛋白的识别另一个则是发生在细胞内的,植物的抗性基因对病原菌基因产生的毒性蛋白的识别,。是非特异性的,在亲和互作或者非亲互作

61、的体系中都会产生,但由于在寄主植物中它不能很好的抑制病原菌的生长,又被称作是基础防御。在植物识别了病原菌后会通过一系列十分保守的信号机制调节防御反应,病原菌的侵染造成的细胞膜渗透性的变化会激活下游的有丝分裂原蛋白激酶家族,如在拟南芥中鞭毛蛋白通过膜上的受体来调节下游的一,。同时,病原菌还能刺激植物细胞产生大量的活性氧从而诱导细胞程序性死亡。,。而后续的研究表明这种大量活性氧的爆发其实来自于细胞内的协同作用,。因此这类活性氧物质不但能直接参与抗病菌的反应,而且也被认为是一种具有信号传递作用的分子,。在整个信号网络中,处于中心地位的是植物激素、、乙烯调节的植物激素信号途

62、径,。起初在拟南芥的相关研究中,利用丰富的生物合成缺陷的突变体,发现调节下游的脐服质合成,相关蛋白和植物抗毒素的积累,甚至是细胞程序性死亡。而后在针对与不同营养类型的细菌、真菌、病毒等的研究中发现,植物其实n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化醉在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究是利用截然不同的、、调节的信号途径来实现防御反应。例如在活体营养病原物的互作系统中,上调的水平来实现超敏反应使细胞死亡,来限制细菌的生长。而在与腐生菌的互作的时候,植物上调和的水平来阻止细胞死亡从而抑制病原物生长。在复杂的自然环境中,植物需要一个极为精巧的信号调控机制来适时的调整防御机制。这就是

63、通过不同信号路径之间的“,,来实现的,。植物对病原菌的感知植物在自然的生长环境中,始终会接触到各种各样的微生物,其中对于病原性的微生物来说,它们必须进入到植物体内来侵染致病。要么直接从叶或根的表面渗透,要么通过植物的损伤部位或者气孔来进入叶片内部。在长期的进化中植物具备了识别病原菌并做出相应防御反应的能力,在人们获得植物对病原菌识别机制的分子遗传学证据之前,都认为是一种基因对基因的识别机制,即病原菌携带的基因,被植物自身的抗性基因所识别。病原菌被植物识别后不能成功侵染的被称作无毒病原物,这样的植株即为抗性植株,这种互作关系是非亲和互作。反之亦然,如果病原菌成功侵染,

64、逃避了植物的识别,即为毒性病原物,植物就是敏感植株,两者关系为亲和互作。现在人们已经十分清楚这一过程的分子机理了,植物主要是通过自身质膜上特殊的感受体,主要是一类胞外的类似受体的激酶对病原菌的一些分子特征进行识别,如鞭毛蛋白、几丁质、麦角固醇等,,从而直接激活下游的卫并指导等转录因子表达防御相关基因或者调节活性氧的生成等等图。n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究蒸翼鬃·“,。。·。。。。,。一黯地·,“。举一图植物抗病机制进化模型伪,。,然而,在病原菌面对植物机制诱导的防御反应时也并不是一筹莫展。它们通过分泌一种特殊的胞外蛋白进入到

65、植物体内来试图抑制植物的防御反应,典型的是番茄致病型丁香假单胞杆菌的护"分泌系统,在侵染过程中能够分泌一种蛋白因子,,它们不但能抑制植物的防御反应阻止植物局部的超敏反应,还能改变植物某些基因的转录,像、、竹,。当然这种共同进化的结果是,使得植物也逐渐具备了识别病原菌毒性蛋白因子的功能,人们发现植物具有一类具有核昔酸结合位点的亮氨酸重复结构域的蛋白,被证明能够专一的识别病原菌分泌的毒性蛋白因子,在拟南芥种即、、即能够专一的识别番茄致病型丁香假单胞杆菌分泌的、、蛋白因子,。可以看出,植物病原菌的这种博弈关系非常有趣,随着大规模基因组测序和生物信息学技术的发展,

66、相信将会对这一过程有更深入的了解。植物抗病反应的信号传递机制以及系统获得性抗性系统获得性抗性是植物一种广泛性的防御机制,通常发生在超敏反应之后或是当n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研究病原物侵染成功后,为了防止更广泛的病原物二次侵染和已侵染的部份扩散到系统叶中而建立的抗性,。系统抗性在植物中广泛存在并且能诱导系统抗性的发生,包括苯并唆二哇和,一二氯异烟酸,一垃创这两个的类似物也能诱导的发生,,币,劫。,,。在烟草和黄瓜中系统抗性的发生和蛋白的表达伴随着的升高,而且在韧皮部和系统叶片上也检测到了浓度的升高,,,,。这使人们一度认为就是

67、植物传递系统抗性的信号物质但是后续的叶片分离实验否定了这个推测,因为在系统信号传递出之后才在叶柄的渗出物中检测到了。,一一伍。,。接下来用基因细菌的水杨酸轻化酶将水杨酸转化为儿茶酚表达植株的嫁接实验也证明了这点。,。尽管人们至今还没了解信号传递的机制,但是得益于相关研究,对调节的抗病信号通路却取得巨大进展。和是位于信号途径上游的两个关键基因,对和的突变体施加则恢复了抗病表型,并且在野生型中,能诱导和基因的表达,。,一。,。说明这两个基因被反馈调节。异分支酸途径和苯丙氨酸代谢途径是植物合成的两个主要途径,基因它编码异分支酸合成酶,它的缺陷突变体中的合成大量减少。也是植

68、物受病原菌侵染后负责合成的基因之一,它编码一个家族的转运蛋白,能够为的生物合成提供中间产物。信号途径的下游是通过来实现调节的,它包括了一个锚蛋白重复的结构和一个户区域,它存在于细胞核和细胞质中功能也有所区分,细胞核中的主要调节一等下游基因的表达,而胞质中的则调节、互作。,。升高改变了胞质中的还原状态,打开了低聚物两个半肤氨酸残基的和二硫键,从而单体的被转运到细胞核内。,几。,与转录因子家族以及蛋白互作来指导基因的表达,其中还包括转录因子家族。另外,也能够不通过直接调节基因的表达,例如通过转录因子,它能直接结合在单链上,,。植物抗病反应信号途径之间的“,,n兰州大学

69、博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究解甲产把甲附界甜砚侧麟阴乎甲砰甲今平甲甲释甲男界冷界娜,黑户昌公。,淤一扮一一"一“口一…`一,图植物防御机制相关的激素信号网络",。,周,近十年里对于植物激素信号途径的互作研究一直是一个热点,现在了解了通过下游、、转录因子以及来实现对信号途径的拮抗作用,当然同时人们也发现了和两条路径有时候也是共同作用的残,,现在可以肯定的是、控制的抗病机制,在植物中起到不同的作用,主要是调节针对抗活体营养型的病原物或者病毒的防御反应。而则是调节针对腐生型病原物和昆虫的防御,。由于两者互相抑制,植物则从中

70、平衡选择最为有效的策略。尽管人们认为、互作是一个双向的过程,但是现有的证据表明,互作的过程更倾向于抑制路径。在关于两条路径生物合成突变体植株的芯片实验中,发现相比,更多的途径的中间基因被抑制了,。除了,其它一些植物激素也被证实与存在互作机制,例如生长素被证明有增加植物对病原菌的易感程度而能削弱这种效应,并且发现在调节生长素氨基酸聚合物的一些酶,能够影响调节的防御反应,说明了两条路径的互作发生在不同的水平图。在植物抗逆境机制中的作用被广泛研究一耐n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究,,,人们同样发现与存在互作,如的类似物能够抑制氯化钠

71、引起的生物合成,同样和氯化钠也同样抑制了诱导的防御反应。,另一个与调节的信号路径联系紧密的乙烯信号路径,同样能够与互作图。。在抗病反应中,乙烯路径往往与途径协同作用,调节下游基因表达。,。很有可能通过抑制途径间接的与乙烯途径互作,因为目前在植物抗病实验中还缺乏直接证据,证明直接与乙烯互作。不过在臭氧诱导的植物坏死过程中,人们发现,和乙烯有相互抑制的作用。。,。。课题的提出植物与病原菌和昆虫的相互作用,一直是植物抗生物胁迫机制研究领域的热点问题。人们对植物如何感知昆虫和病原菌侵害并做出防御反应的机制已经有了大体的认识。与此同时,大量的研究也证实了线粒体交替氧化酶在植物

72、抗非生物胁迫机制中扮演了重要的角色。那么,交替氧化酶是否也参与了植物对昆虫和病原菌的防御呢答案是肯定的。一方面生物胁迫与非生物胁迫具有很多相似性,比如昆虫对植物的啃咬就直接对植物产生了机械损伤的效果,病原菌的侵染也能诱导植物细胞活性氧的爆发,产生氧化胁迫的效果另一方面,交替氧化酶作为维持线粒体正常生理功能的蛋白与一切影响植物正常生理水平的外界刺激都紧密相关。特别是最近纪念线粒体倒置学说的提出,表明线粒体在植物应对逆境过程中的重要作用不仅仅是被动的调整自身代谢水平作出反应,而是能够通过一些次级信使主动调控细胞核相关基因的表达。传统抗虫抗病研究,大多围绕着信号路径和信号

73、路径相关的基因所展开,通过与这两种防御性激素生物合成或者信号传递相关的基因突变体,来逐渐弄清整个防御系统的构成。在我们的前期研究中发现,二点叶蜗侵害的菜豆、妙叶片中,交替氧化酶调节的抗氰呼吸路径活性显著升高,暗示植物的交替氧化酶很有可能在这一过程中起到一定的作用。同时,被侵害叶片中植物激素的含量也明显升高,而早已被证明和线粒体的呼吸十分相关,特别是能够刺激交替氧化酶基因的表达。那么在植物对病虫害防御过程中,升高为什么会调节交替氧化酶基因的转录呢而交替氧化酶的功能又会是什么呢带着这样一系列的问题,我们以北美野生烟草"、烟草天蛾幼虫、小绿叶蝉五呷番茄细菌性斑点

74、病双口口为互作研究的对象,通过构建交替氧化酶基因沉默的转基因烟草来验证交替氧化酶在不同的互作背景下的生物学功能。探讨交替氧化酶在这一过程中的生物学意义无疑开启了人们对植物抗病虫害研究的全新视角。由于交替氧化酶基因在植物中的生n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究物学功能也一直是个未曾完全阐明的问题,本课题的研究也必将丰富人们对交替氧化酶基因功能的认识。n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研究第二部分交替氧化酶在烟草针对咀嚼式昆虫烟草天蛾幼虫防御机制中功能的研究烟草和烟草天蛾幼虫是植物抗虫领域一个研究十分深

75、入的体系,由于其在野外环境中真实存在,这就赋予了相关研究特殊的生态学意义,。。,。在研究中发现,烟草的抗虫反应能够被烟草天蛾幼虫的唾液所刺激。,,这个发现在一定程度上促进并规范了植物抗虫的研究。通过将昆虫唾液直接涂抹在叶片机械损伤的部位,不但模拟了昆虫啃咬的过程而且还保留了充足的植物样品用于分析。大量虫咬后植物叶片的芯片分析显示,绝大部份与生物合成相关的基因被诱导上调了,,而对模拟虫咬处理叶片的植物激素的测定也发现在处理后一小时的积累出现一个峰值,这暗示在植物对昆虫防御过程中的重要作用。因而,后续的大部分研究也围绕着植物生物合成的基因展开,意料之中的是关于生物合成的

76、关键基因的沉默突变体都降低了植物的抗虫能力,比如脂氧合酶基因等,。接着人们发现,对防御反应的影响其实需要通过与异亮氨酸的结合态来实现,在沉默了、基因后同样削弱了植物的抗虫能力,研,。更重要的发现来自于信号通路的下游,借鉴植物抗病领域的研究进展,发现一的结合物其实只是信号传递过程中的一步,它需要蛋白来感受并将信号传递给转录因子,指导下游相关基因的表达,,,,,。在前期的芯片数据中,基因作为一个与线粒体相关的基因同样被烟草天蛾幼虫的唾液所强烈诱导了,,这暗示着烟草的蛋白有可能参与到了烟草抗虫的防御机制中。此外,机械损伤这些非生物胁迫也被证明能够诱导植物的基因的转录,并引

77、起植物的抗氰交替呼吸途径的变化,。特别是蛋白被认为能够在植物线粒体呼吸链被阻断或抑制时,防止线粒体泛醒库处于过还原状态并生成活性氧进而损害线粒体正常的生理功能,、乞,。当植物在被昆虫啃咬的同时也不断受到机械损伤的刺激,并且在各种植物激素的作用下,需要进一步调整呼吸代谢水平来满足防御产物的生成。因此,这就需要蛋白的表达来维持植物线粒体的氧化还原平衡状态。为了验证这些假设,在这一部分实验中主要通过对比野生型和基因沉默植株抗虫能力的不同,例如抗虫相关的植物激素以及次生代谢产物的积累,来证明基因在烟草抗虫机制中的作用。n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机

78、制中功能的研究材料和方法植物材料的培养烟草从`口为第代自交品系,种子采自美国犹他洲野生种群,所有转基因和野生型供试植株均来自该品系。萌发前种子需经消毒,消毒液的具体配方为二氯异氰尿酸和林一以及纯水。而后需要经加有哪的赤霉素刃认因切丙一的液体诱导萌发小时,再转移到灭菌的培养基上洲。培养十天后,幼苗转移到如盆中,再经过一天,转至的花盆中,光照时间,光强度为一脚一一",一培养,相对湿度,。烟草交替氧化酶基因沉默的转基因植株的构建和鉴定一段的烟草基因片段连接到的转化载体里形成一个反向倒置序。再通过农杆菌将该质粒载体转入到野生型的烟草中,具体步骤参照,的方法。由于质

79、粒带有潮霉素帅的抗性,转化植物可以用潮霉素来进行筛选。再通过鉴定插入并进一步筛选纯合子。模拟虫咬诱导处理将烟草天蛾几念幼虫培养至第一蜕皮期后,采集昆虫唾液并与去离子水混合稀释备用。选择莲座期时对植物进行诱导实验,挑单一过渡期的叶片,用小齿轮处理叶片后将稀释的昆虫唾液林涂抹于植物伤处,根据实验设计,间隔一定时间采样每个时间点设立个独立植株作为生物学重复,并将样品于液氮中保存。烟草天蛾幼虫虫咬处理用新鲜孵化生长天的烟草天蛾幼虫,取莲座期植物叶片投放只幼虫于叶面上并用通风的塑料笼子将其圈养,对照组则为空笼子固定的叶片。然后每隔天进行采样,每个时间点设立个独立植株作为生物学

80、重复,并将样品于液氮中保存。提取和基因转录水平的荧光定量测定在液氮中研磨采集的处理叶片,称量一的样品粉末。依据洲脚公司的提取方法,提取植物叶片总,并用五洲测定样品洲含量。用林的来做的处理加入的一和缓冲液,具体步骤参照产品说明书刃访叭八刀。而后将样品加热分钟,对酶进行灭活。用酚氯仿异戊醇和体积的醋酸钠和体积无水n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研究乙醇一℃进行沉淀。最后林的用来作模版用一洲介溯为引物,用反转酶进行合成。检验基因表达的转录水平,我们使用一试剂盒洲门万操作过程遵循产品说明书。为了检验未知基因的转录水平,我们根据己知的基因序列

81、设计相关引物见附录,样品均出自个不同的生物学重复,一切数据均出自荧光定量系统。烟草叶片中植物激素的测定在液氮中研磨采集的处理叶片,称量一的样品粉末,然后用加有内标,"、、一,"等的乙酸乙醋进行提取。提取过程加入的而在匀浆机中进行匀浆分钟。经转℃离心分钟,将上清液转移到的管中,对沉淀再进行一次纯乙酸乙醋的抽提后重复上述步骤。将两部分所得的上清液放入真空旋转干燥器中,进行℃挥发干燥。最后加入川甲醇重悬。用拼上样,液质联用、乞,,,丽负离子化后对各成份根据内标进行定量。烟草叶片中次生代谢产物的测定次生代谢产物的测定采用高效液相的方法具体参照抓。,。植物

82、样品经液氮研磨以后,分装在盛有。乡的的管中,而后用混有乙酸和甲醇的溶液进行抽提,经匀浆机中进行匀浆分钟后,转℃离心巧分钟。过后,转移上清液到新的管中,再次重复离心步骤,而后转移以到样品管中,经一系列切洲认邢叨分析,采用一反相柱娜,并且连接伽前置柱。溶液选择相为水溶液相为乙睛,溶液洗脱系统为,一分钟,一相一分钟,一相一分钟,一相。流动相流速设定为,上样量为抖,柱温设置在。这样尼古丁洗脱时间在,检测波长为绿原酸,咖啡多胺,二咖啡精胺洗脱时间在,,检测波长为犯芸香普洗脱时间为检测波长为二帖糖贰洗脱时间为一检测波长为。烟草天蛾幼虫虫咬实验抗虫实验用新鲜孵化生长天的烟草天蛾幼

83、虫进行,不同基因型植株用不少于株作为生物学重复来进行实验,选择莲座期植物投放昆虫,天后开始称量幼虫体重,每隔n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研究天重复一次,最后根据数据绘制幼虫生长曲线。实验结果与分析烟草同源基因的蛋白序列比对通过已知的基因的序列我们克隆了中的基因的全长,并进行了基因全长的测序。由图可以看两个序列在蛋白水平高度同源。所有相同的氨基酸区域都用黑色的背景标识出来。画工翻呱巫亚肠画画贾圈盛习困颐颐四政哑翻由妞哑翔砚吻哑酬时咖嘟皿画翌魔己哑工团更困翻画骊面画盈图贾困更扭呱胭网颐皿砚班卫映皿预颤目函哑泪团一画书一畏工现圃王担亘

84、哑哑哑蓝顺口恩卿皿八皿颐卫皿亚皿三翻呱艘咖脚玉颐颐犯必巫目叻哑口习孤医困恤巫圈互亘盛三旦盛皿亘盛渝哑翔至己圃理皿皿硬应巫圆胭哑担团口肠即座皿画脚颐捆四画困函蔽画便皿顺圈困更硕颐曰肠盟画鲤皿圃哑困恩咬己几理舀圈哑颐刃厕骊班画蕊哑面甄醒团圈吸翻顾皿刃睡困函吸皿贾函圈咏恤盈互盛皿颐困皿困互砚盈己画威画圃由哑画画画如图田砚圃圃团只皿函亚砚日皿睑豆习亚皿面刃属巫蓝亘画网互吸观三亚酒贾己且噩画颐噩且盔刃皿现颤哑皿亚图蛋白质序列和同源蛋白质的比对。灿认丫,烟草转基因沉默载体图和对基因拷贝数的鉴定使用的转化载体为,基因片段反向插入的位点见图。对基因在烟草基因组中拷贝数的鉴定为两个拷

85、贝,见图。这表明基因可能存在的基因家族成员。同时我们还根据转录组测序结果来试图比对该基因的其它基因家族成员,在所有已知的序列中,只发现一个与该基因相似度很高的同源基因,见附录图。经比对发现我们无法选择出的特异性片段进行分别沉默,因此设计的基因沉默载体将会同时沉默这两个基因。nn兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究模拟虫咬诱导处理后烟草基因的转录水平由图可以看出对比未经任何处理的对照叶片,用齿轮机械损伤叶片并涂抹水十和涂抹昆虫唾液的处理使得基因的转录水平显著上调了。在两种处理过后巧分钟,叶片中基因转录水平就已经开始明显高于无处理对照的

86、叶片了,到分钟时达到了基因转录的最大值,在小时以后开始逐渐下降。有趣的是,昆虫唾液处理对基因转录的刺激更为强烈,这体现在转录最高峰时高出大约的表达量。并且有较为滞后的下降趋势,在小时后水处理组的转录值己经恢复到正常水平,但是唾液处理组仍高出大约,这表明昆虫唾液对基因转录有特异性的刺激作用。之次德一号长和巴。··二。一一协卜一协卜王入,图烟草基因转录对模拟虫咬处理的响应。图中各点为荧光定量测定的烟草基因转录相对丰度的技术重复平均数。样品取自无处理对照,水处理,唾液处理不同时间点的五个不同植株。汉哪仕腼"田叭印,咔一另外,长时程的采样分析让我们发现在小时后基因

87、转录呈现一个波状调控,因为三种不同处理样品变化趋势回归一致,可以排除不同处理的效果,因此根据采样时间点的设置,推测该基因很有可能受到光照变化或昼夜节律的调控。烟草天蛾幼虫虫咬后烟草基因的转录水平为了更全面了解烟草基因对昆虫啃咬的响应,我们还同时对昆虫取食后天一天的样品进行了基因转录水平的荧光定量测定。图中白色柱状图为未处理对照植物,黑色柱状图代表烟草天蛾幼虫取食到天的样品,与模拟虫咬处理的实验一样,持n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究续的昆虫啃食使叶片中的的转录水平始终维持在较高水平,意味着在真实的昆虫与植物互作过程中,基因的转录

88、对昆虫取食有高度响应。不过随着实验的进行,基因转录开始逐渐下降,分析这可能与叶片的年龄或者生理状态有关。口县妇一比次妇己妇招巴。`图烟草基因转录对真实虫咬的响应。图中柱状图为荧光定量测定的烟草基因转录相对丰度的生物学重复平均数。样品取自对照、虫咬后一天个不同植株。星号代表在统计学检验差异。入乞汉口万士入乞」"即、笼刀,转基因烟草中基因的沉默效率在对昆虫唾液诱导的基因转录水平的定量实验中,我们知道在分钟时的转录水平达到了最高峰。因此,我们同样选择该时间点来比较突变体中基因沉默的效率图。在所鉴定的两个纯合子和的品系中,可以看到基因沉默的效率十分显著。在未处理的

89、小时样品中,两个品系该基因转录量就已经不足野生型的,这个差距在诱导后分钟的样品中更为明显,转基因植株中基因表达的丰度仅为野生型的。这证明我们构建的基因沉默载体有效的抑制了基因的转录,为我们验证该基因的功能奠定了基础。n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究加`习狄峨长一和归乏巴。﹄区么习映一夫月一图转基因烟草中基因的沉默效率。图中柱状图为荧光定量测定的烟草基因转录相对丰度的生物学重复平均数。样品取自小时对照和模拟虫咬处理后小时的个不同植株。星号代表在统计学检验差异入乞汉丫件入乞月口万一七刀,模拟虫咬诱导处理后烟草叶片中植物激素的水平植物

90、激素,是植物抗病虫害系统中最为核心的激素信号分子,特别是被证明在植物的抗虫机理中位于主导地位,因为绝大部份与生物合成或者信号传递的基因缺陷突变体被证明降低了对昆虫的防御,。另外根据卿的研究,我们知道在诱导处理植物叶片后,至小时内叶片的积累会出现一个短暂爆发,这个爆发的峰值出现在小时左右,并且此时激素信号的积累,将直接影响到植物抗虫的能力”叭。,。因此,我们分别对野生型和沉默突变体进行模拟虫咬的处理,并在、、、小时候进行采样,测定植物叶片内部激素的变化。由图和可以看到对野生型和突变体、模拟虫咬的处理比水处理的的叶片诱导出大量的、一的积累但是在野生型和突变体中并没有显著

91、性的差异表明沉默基因并没有影响到、一的生物合成。对和的测定也没有发现显著性的差异图和。区别与、一,在处理三小时内两种激素都基本维持在一定水平,模拟虫咬诱导的处理并未诱导这两个激素水平的变化。n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研究叭陌三陋,曰吸内月︺到,参口︵︶,爹比口︵︶,哎,。。。"飞"。。。黝二公一雁一`一"`一飞“上,朋一了一二磁,气习印︵,﹂︶,女︵﹂一·一哎,·,︶,口内`必书,︵比︶︵尸﹂︶口乙哎﹂巴﹂﹄涵曰月,。尸含匡︵︶︵,︶口哎戒咤口一图野生型和转基因烟草模拟虫咬诱导后的激素水平。图中柱

92、状图为激素含量的生物学重复平均数。样品取自。、、、小时后对照和模拟虫咬处理的个不同植株n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研究扩·仕、、、烟草天蛾幼虫虫咬后烟草叶片中植物激素的水平朋口〔二习一加比尸味︶︵尸弓︵口︶,,甘闷,叫月才﹃注胜`尸女︵︶。女匡。︵一口一,哎,哎,︶口匕布一匕︶叫闷`二︵,﹂︶口︵尸,﹂︶哎认﹄哎认﹄n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究︵,︶口︵,﹂︶切口口哎图野生型和转基因烟草真实虫咬诱导后的激素水平。图中柱状图为激素含量的生物学重复平均数。样品取自。、、、天后对照和模拟虫咬处

93、理的个不同植株撇仕、、、盯为了更全面的了解真实虫咬条件下,野生型和转基因植物的激素水平的变化。我们对虫咬后至天的样品进行了植物激素的测定,与模拟虫咬结果相似,真实虫咬同样刺激产生了较高的和一,并且由于持续不断的诱导使激素水平在采样的三天内一直维持在较高水平图、。不过野生型和转基因植株同样没有显著差别,再一次从植物激素水平证实了基因的沉默并没有影响到植物中抗虫相关防御激素的水平。同样虫咬条件下植物的水平略微高于野生型,并且植物的水平也逐渐升高这可能与采样的叶片年龄相关。烟草天蛾幼虫虫咬后烟草叶片中防御性次生代谢产物的水平拍怕日细八甘几甘习卜丁二奋二句即,全︵二,甘内`

94、自一﹃﹄二二二到卜岌万工二,,,,,“`一材一一一一,尸一一一一丫一一一一,一之n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究,女︵的】答器。忿。朋主,一,,一,艺犷》一二扩二侧,名一润比舀动江熟二︶。,工月甘匀﹄“八之之幸之,一一诬爹护二︵﹂望︶︻日。月垂一“一队之之吐二一圣n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究尸女己一名一望任舀考︵︶﹄。一,,一扮寸卜习,,,,,,,,,“一“一一“一一一一一,一一一一—一—一一——飞】二,女比倒︵﹂几︶一曰,江`,一"一壬一李,一一一一一一,一一一一—一尸一一一

95、一一一一一,一门一,图野生型和转基因烟草真实虫咬诱导后次生代谢产物的水平。图中曲线图为次生代谢产物含量的生物学重复平均数。样品取自、、、天后对照和模拟虫咬处理的个不同植株掀件汀、、、”烟草天蛾的引起植物激素的变化,会通过信号的传递而最终引起植物一系列防御性次生代谢产物的变化而其中尼古丁、二咖啡精胺七,二菇糖贰印邪、咖啡腐胺、绿原酸、芸香昔被证明在植物抗虫机制中具有重要作用,,,,。因此,我们同样测定了这些代谢产物的含量的变化,由图可以看出连续天的虫咬并没有引起这些次生代谢产物的变化,除了在野生型和植物中二帖糖贰有逐渐升高。不过该成份在野生型和植物中没有明显的差别。比

96、较有趣的是,在虫咬后二咖啡精胺的含量在植物中含量较高,并且芸香普也有着同样的趋势,而这两种物质与植物的抗氧化性有着极为紧密的联系,作为一类抗氧化作用的物质能够与过氧化氢结合,证明植物在受昆虫侵害后,n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研究可能处于一种“氧化胁迫”的状态而需要这类类黄酮类物质来提高抗氧化能力,由于野生型中并没有积累此类物质,表明植物很有可能由于基因的缺失,而处于一种氧化胁迫状态从而调节了此类代谢产物的积累。烟草天蛾幼虫虫咬实验,工弓逻应又︵口︶任之舀月工…图野生型和转基因烟草虫咬实验。图中柱状图为烟草天蛾幼虫重量的生物学重

97、复平均数。样品取自个不同的生物学重复土几在探讨了基因沉默对植物抗虫相关的激素和次生代谢产物水平的影响后,我们虽然没有发现该基因的沉默影响了植物的这两个重要的抗虫能力的指标,但是仍然需要进一步进行虫咬生物学检验,来确定该基因的沉默并没有影响植物实际的抗虫能力。通过投放烟草天蛾幼虫后的至天内不断监测幼虫的体重加,我们发现生长在和野生型植株上的幼虫没有明显的体重差别如图。这说明基因的缺失没有改变植物抗虫能力,并且也没有影响到昆虫的生长。讨论大量文献证实了蛋白参与了植物抵御各种逆境的机制,,、乞,一,,。其原因是被认为当植物细胞面对各种逆境胁迫的时候,能通过调节线粒体呼吸来

98、维持泛醒库的氧化n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究还原平衡状态从而抑制活性氧的生成,。昆虫对植物的侵害作为一种常见的生物胁迫,也诱导了植物基因的表达,,并且在我们对基因转录的研究中发现该基因能够特异性的被昆虫唾液刺激表达,见图。那么是否也同样参与到了植物对抗昆虫的防御机制当中呢为了全面的阐述这个问题,了解烟草的基因在植物针对昆虫的防御机制中的角色,我们比较了沉默基因的转基因烟草和野生型在抗虫能力方面的区别。作为调节植物抗虫机制最重要的激素信号,在植物昆虫互作领域被广泛研究,它被证明几乎参与到了植物针对各类昆虫的防御反应当中,,。因

99、此,我们考察了基因沉默对烟草生物合成的影响,希望以此弄清如果基因参与植物的抗虫反应,那么这个机制是否依赖于调节的防御体系。通过至小时内对植物的模拟虫咬诱导处理,发现野生型和植物之间并没有在激素水平产生差别,见图。在小时后植物同样积累了相同水平的、一。由于蛋白能够直接调节植物的呼吸代谢水平,影响循环的各个中间产物的积累,该基因也有可能是在代谢水平,直接调节植物防御相关的次生代谢产物的水平,因此我们同样对相关次生代谢产物尼古丁、二咖啡精胺、二菇糖贰、咖啡腐胺、绿原酸、芸香普进行了逐一测定,结果同样没有发现显著差别,如图。为了还原真实状态下昆虫取食对植物的影响,我们也设计

100、了虫咬实验并对真实虫咬后的植物样本测定了相关指标并得到了一致的结果基因的沉默并没有影响到烟草在防御咀嚼式昆虫烟草天蛾幼虫过程中、一等防御激素的积累,同时也没有影响到下游的次生代谢产物的水平见图、。最后,我们称量了烟草天蛾幼虫在取食和野生型烟草后的体重增长,依旧没有发现基因的沉默对昆虫的生长带来任何差别。通过以上实验,我们得出结论基因的沉默没有影响烟草对抗烟草天蛾幼虫的能力,而昆虫的取食对于基因的诱导可能是由于在植物组织正常生理状态被破坏后的一种被动的反应,类似机械损伤对植物短时间内的刺激。n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究第三部分

101、交替氧化酶在烟草针对刺吸式昆虫小绿叶蝉防御机制中功能的研究在自然环境中植物将面对各种各样的昆虫和病原物的侵害,在长期的互作过程中植物逐渐进化出的防御系统,能够针对不同的情况做出反应。像在对昆虫和病原菌的防御机制中,植物就能区别这两种不同的危害采取以和为主的不同的信号途径,调节下游防御反应分别应对。同样,即使对普通机械损伤和昆虫啃咬时也能有所区别。在上一部分实验里,我们讨论了基因沉默对烟草防御烟草天峨侵害能力的影响,综合各方面的实验数据,我们并没有发现该基因的沉默对烟草抗虫能力带来变化。显然烟草天蛾作为一类典型的咀嚼式昆虫,仅仅针对它的研究并不能对基因在植物防御系统中

102、的功能做一个全面的结论。因为在复杂的自然环境中,植物将面临各种各样昆虫的威胁,在年的美国犹他洲野外实验基地,我们就观测到同样种植在户外的野生型和植物,植物更容易被一种刺吸式昆虫一小绿叶蝉侵害,并且在叶片表面形成了大片的坏死区域,那么是否基因在烟草针对刺吸式昆虫的防御体系中有着特殊的作用呢本部份将从野外和温室的实验中记一步分析基因在烟草与小绿叶蝉的互作过程中的角色。小绿叶蝉是节肢动物门、有颗亚门、六足总纲、昆虫纲、有翅亚纲、同翅目、蝉亚目、叶蝉科的一种,成、若虫能够吸食植物汁液,植物被害叶初现黄白色斑点后逐渐扩成片,严重时全叶苍白早落。主要的寄主植物包括棉花、茄子、菜

103、豆、十字花科蔬菜、马铃薯、甜菜、水稻、桃、杏、李、樱桃、梅、葡萄等。在抗虫研究中,对这类昆虫的研究还是较空白的领域,相对类似的研究是针对蚜虫口兀绝和二点叶瞒的研究,而关于这两类刺吸式昆虫所刺激的植物抗虫反应与咀嚼式昆虫诱导的反应截然不同,通过对转录基因的研究和对植物激素的测定,发现刺吸式昆虫往往诱导了植物叶片中的积累和相关信号途径基因的上调,。,一。,,。表明此类昆虫更依赖植物的相关的防御途径。其原因在于,人们发现植物对这类昆虫的识别其实更接近与与病原菌互作的模式。首先,可能是基因对基因的识别机制,这点类似病原菌研究的,如蚜虫被证明它们的口器分泌物中的刺激因子能够结

104、合植物质膜上的亮氨酸重复的核普酸结合位点,或者通过刺吸式昆虫独特的取食方式引起的细胞坏死来做出识别,还有可能由于这类昆虫自身携带的病原物同时感染了植物,植物通过识别病原物来做出反应。,。n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和杭病机制中功能的研究材料和方法植物材料的培养烟草为第代自交品系,种子采自美国犹他洲野生种群,所有转基因,以及野生型供试植株均来自该品系。种子消毒和萌发方法同第一部分。烟草与小绿叶蝉互作的温室和野外实验温室实验将处于莲座期的野生型和植物共同放置在培育小绿叶蝉的培养箱中,为排除位置和数量的影响因素将相同数量的两种基因型植株,混合散开摆放。

105、而后每隔天选择个独立植株的单一叶片采样,直到第天实验结束。野外实验野生型和植物同时播种到美国西南部的犹他洲沙漠,种子萌发前需经消毒分钟消毒液的具体配方为二氯异氰尿酸和林一以及纯水,而后需要经加有林的赤霉素洲氏叨一的液体诱导萌发小时。最后转移到灭菌的培养基上。在℃脚一“一"光照和℃黑夜的条件下培养天。然后将幼苗转移到花盆中洲并浸入硼砂水溶液中水幼苗用富含铁离子的水溶液灌溉具体配方和,使用前需稀释倍再过天后逐步让幼苗适应野外环境,需要在野外带网眼帐篷中进行练苗,而后转移栽培到野外。在对转基因植株野外栽培时,严格按照条款一一,所有植株必须在开花前收割或者销毁。在

106、天内对植物叶片遭受昆虫侵害的程度进行连续统计,以单一叶片损伤面积的百分比作为衡量标准。提取和基因转录水平的荧光定量测定同第一部分。烟草叶片中植物激素的测定同第一部分。烟草叶片中次生代谢产物的测定同第一部分。其它转基因烟草与小绿叶蝉的互作实验将、、、等转基因烟草放置在培育小绿叶蝉的培养箱中,天后记录虫咬对各个基因型叶面造成的破坏。实验结果与分析n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究小绿叶蝉的侵染对烟草叶片造成的损害冰卜口巴`卜口任。召岁︵佗洲︶。加石n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究图小绿叶蝉对烟草叶

107、片的损害。图为被小绿叶蝉侵染天后野生型和植物的照片。图柱状图为受小绿叶蝉侵染后损伤叶面积百分比生物学重复平均数,样品取自个不同的生物学重复。图柱状图为野外实验中受小绿叶蝉侵染后损伤叶面积百分比生物学重复平均数,样品取自个不同的生物学重复。星号代表在统计学检验差异,罗妙肠梦丫件,件,一月笼由图可以清晰的看到小绿叶蝉侵染天后,在植物叶片上造成的损害更为严重,出现了类似病原菌侵染的植物细胞坏死。通过对植物叶面积损坏程度进行统计,发现在植物的损伤面积在左右,高出野生型图。并且野外实验数据完全印证了在自然环境条件下植物同样更容易受到小绿叶蝉的侵害,在观测的天内在植物上的叶面损

108、伤面积始终高于野生型图。小绿叶蝉侵染后烟草基因的转录水平为了进一步详细了解小绿叶蝉对植物带来的侵害和影响。我们在实验开始后间隔四天采样,来连续的观测植物各个方面生理指标的变化。首先一个需要弄清的问题是,小绿叶蝉的侵害是否能像烟草天蛾幼虫一样刺激基因的表达。由图可以看出在采样的天里,受侵害的植物叶片中基因持续被诱导表达,表明基因确实有可能参与到了植物防御小绿叶蝉的机制当中。。口召`巾冬二刁名,」寸目呀`牙恤勇公之荡二…三`。心—石伽n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究图烟草基因转录对小绿叶蝉虫咬的响应。图中柱状图为荧光定量测定的烟草基

109、因转录相对丰度的生物学重复平均数。样品取自对照和虫咬后、、天的个不同植株。星号代表在统计学检验差异,,入乞月士入乞注口尤、七五刀叨小绿叶蝉侵染后烟草叶片中植物激素的水平同样,我们也测定了小绿叶蝉侵害叶片中激素的水平。可以从图看出虫害诱导了植物叶片内的积累,而在植物中,的积累远远超过了野生型呈显著性差异。特别是在第天叶片坏死表型最为明显的时候,积累的达到了一,,是野生型中的两倍。这说明的积累可能与植物叶面的坏死有一定的内在联系。有趣的是,在抗虫反应中主导地位的、一并没有像烟草与天草夜蛾互作时那样维持在较高水平图、。分析原因,这可能是由于在真实虫咬实验里采样无法精确控制

110、,因此错过了一小时左右时的爆发,或者也有可能是相对高的浓度抑制了在叶片内的积累。这种高积累而没有响应的结果,表明了小绿叶蝉这个互作系统区别与咀嚼式昆虫的特殊性。根据以往文献的报道推测可能是由于这种刺吸式口器的昆虫,携带了病原物进入植株,造成了这种类似病原菌的反应。另外,的含量也随着采样时间逐渐上升,但是在野生型和突变体中并没有显著的不同,并且也在对照植物中有类似现象图。这则是由于植物叶片的年龄等因素造成的。石南。花〔二】桥理书怡惬俨之匡︵︶`︵卜︶嘴的哎福性加、、帷半】n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究工了几︵尸﹂︶切︵,比乌乌亡

111、︸的`臼今︵,比︶,·哎口哎口节伽图野生型和转基因烟草在小绿叶蝉侵染后的激素水平。图中柱状图为激素含量的生物学重复平均数。样品取自、、、天后对照和小绿叶蝉侵染处理的个不同植株。星号代表在统计学检验差异。力护胡仕、、、,。n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究小绿叶蝉侵染后烟草叶片中防御性次生代谢产物的水平通过对植物激素水平的测定,我们发现小绿叶蝉的侵染对植物体内的激素水平产生了很大的影响。而对植物次生代谢产物的研究,我们则发现了这种激素水平的变化,很大的影响了植物防御性次生代谢产物的积累。特别是发现的尼古丁、咖啡腐胺、二菇糖贰这三个被

112、证明与植物抗虫及其相关的化合物含量,在植物中都明显下降了图、、并且呈统计学显著差异。在第天样品中,以上三种化合物在野生型种开始大量积累,并且在实验周期内呈上升的趋势,与植株产生了鲜明的对比。石自尸月…一一︵一﹂︶一︸乞一诬出二二几二,一…好斗丫丫一,,,,,,一诬一“、呼,一,,,七一妇考。,夕,岂,。。︶口二…口吧吕二`二盏“一`之之、劣二辜一,竺`多攀,尸一一一,—一一一—一一一一一一飞一一一一一一一一,,,,尸考比盆︵口门巴卜价,吧乡呀`…`哥留一“··一庵··一"岌〔二一。,,一圣勺一一一州一一一丫一一一一冲一一丫一一气尸一一一—一一一一一叫一一一

113、一,,n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究必七一后熟舀︸。誓,“,吟一一一一一一一一一一一,一厂一一一一一一一州一一一一—一一刁刀仙跳也艺上口。侣︸仙甘臼盔尸考︵份﹂。图野生型和转基因烟草小绿叶蝉侵染后次生代谢产物的水平。图中曲线图为次生代谢产物含量的生物学重复平均数。样品取自、、、天后对照和小绿叶蝉侵染处理的个不同植株。星号代表在统计学检验差异。士、、、,,七刀从大体上看,在植物中三中成份基本维持在起始水平上下,而我们知道这些化合物都是信号途径调控的下游防御性次生代谢产物,在植物激素的测定中以及一水平的维持不变,与这里次生代谢产物

114、的测定结果相互呼应,表明在植物中主导调控的防御反应确实被抑制了,而抑制的原因则是因为较多的积累。,,,等转基因烟草与小绿叶蝉的互作实验上一部分关于植物次生代谢产物的测定,让我们知道在植物中尼古丁、咖啡腐胺、二菇糖贰这三种重要的烟草抗虫防御相关的成份含量大幅减少。那么一个直接的问题就是,这三种代谢产物哪一种的缺失影响了植物抵抗小绿叶蝉侵染的能力呢还是n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和杭病机制中功能的研究三种化合物缺失的共同效果击口乌。︵口门改︶。中一石而名心一图小绿叶蝉对、、州丙习、等转基因烟草的侵害。图为被小绿叶蝉侵染天后野生型和、、仕、植物的照片。

115、图柱状图为受小绿叶蝉侵染后损伤叶面积百分比生物学重复平均数,样品取自个不同的生物学重复。星号代表在统计学检验差异,妙五仰、心、、、心、让、仕妙公即口“`口丘思,拓,曲万、州、、n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和杭病机制中功能的研究为此,我们应用了多个不同的转基因品系,其中包括是尼古丁生物合成的腐胺甲基转移酶沉默的转基因植株,该植株不能诱导合成尼古丁,。是沉默了生物合成途径上的脂氧合酶的转基因植株,该植株中不能被昆虫侵害诱导积累从而不能刺激下游防御相关的次生代谢产物的合成,。是转录因子沉默植株,该转录因子直接调控类苯基丙烷和多胺的结合物产生,沉默它会使

116、得植物不能积累咖啡多胺和二咖啡精胺。,。饰是沉默了垅牛儿基垅牛儿基焦磷酸合成酶,减少了二菇糖贰的合成前体该植株不能积累二菇糖贰,。由图、可以看出,在小绿叶蝉侵染天后在冲和烟草叶片上的损害最为严重。这说明尼古丁在烟草对抗小绿叶蝉的防御中的首要作用而同时还证实该防御体系是依赖于调控的信号途径,虽然我们并没有在激素测定中发现的升高,这也证实了我们的推测,激素测定结果可能是由于真实叶蝉的虫咬方式使我们在采样时错过了爆发的时间。而在和植物叶片上,并没有发现有统计学差异的叶片坏死如图、这表明咖啡腐胺,二菇糖贰的降低没有影响烟草对抗小绿叶蝉侵染的能力。讨论在探讨了基因在烟草针对烟

117、草天蛾幼虫的防御机制中的作用以后,显然我们并不能就此对基因在植物抗虫机制中的角色下一个全面的定义。因为在后续的野外实验中,我们就发现关于基因是否参与烟草抗虫的研究不能仅仅局限于烟草天蛾幼虫这一种研究对象。在自然环境条件下,植物显然要面对各种各样昆虫的侵害,而烟草就更容易被小绿叶蝉,一种刺吸式昆虫所侵染。由植物叶片损害面积的统计图,可以看出烟草叶片被侵害的面积更大,并且从温室中得到的实验结果和从野外观察到的实验数据十分一致,这表明了参与烟草抗虫机制的特性。虽然区别于烟草天蛾的取食方式,小绿叶蝉的侵染也同样能诱导了烟草基因的转录图。那么是什么原因促使植物针对小绿叶蝉的防

118、御能力下降了呢关于植物激素和次生代谢的测定实验中,我们发现小绿叶蝉的侵染使和野生型烟草叶片内的含量持续升高,但并没有像烟草天蛾那样持续刺激含量的升高,而且在植物中的含量远远要高于野生型图。在下游的防御性代谢产物中,我们更是惊奇的看到,植物中三种重要的次生代谢产物尼古丁、咖啡腐胺、二菇糖贰的含量都显著下降图。。所以整个机制就变得比较清楚了小绿叶蝉首先通过某种未知的机制影响了植物叶片中的积累,而较高的水平被证明会抑制调控的防御反应。,。从而导致了我们在下游次生代谢产物测定时看到的在植物中几个重要的信号通n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研

119、究路依赖的次生代谢产物没有被诱导起来,使得植物表现的更为容易受到小绿叶蝉的侵害。接着我们同时用、、、这几个转基因植物证明了信号通路被抑制以及尼古丁的含量下降是更易受小绿叶蝉侵害的原因图。显然这个过程中,对调节叶片中的积累有着举足轻重的作用,不过仍然摆在我们面前的一个问题是为什么小绿叶蝉能够引起烟草叶片的积累,在跟其它刺吸式昆虫的研究进展进行对比后,不难发现在植物针对这类刺吸式昆虫的防御机制中的重要作用,,,,一,,。人们在针对蚜虫和二点叶蜗的研究中发现,和可能共同调节了植物的防御反应,由于这类昆虫的取食方式能够成为一些病原物的载体,因此会使寄主植物也同时出现病原物感

120、染的反应,可能这就是为什么在小绿叶蝉侵染过的叶片的水平逐渐升高。除了病原菌感染的原因,还有可能是刺吸式昆虫引起的植物的细胞坏死所造成的,因为刺吸式昆虫对植物叶片造成的损害会是叶片组织产生大量的,这可能是诱导细胞坏死的原因,同时这种叶片组织内的氧化还原水平的剧烈变化同样会诱导植物产生酚类化合物来作为抗氧化剂,这同样需要苯丙氨酸代谢途径上调和的积累,。所以在小绿叶蝉侵染后表现出来的更大面积叶片的损伤和的积累,很有可能是因为小绿叶蝉带入的病原物侵染或造成的活性氧的积累而放大了烟草由于基因的沉默不能应对氧化胁迫的本质。因为我们知道蛋白一个重要的功能就是被认为参与到了,植物抗

121、氧化胁迫硒厄,,、乞,和调节细胞程序性死亡的机制、,当中。而咀嚼式昆虫由于将叶片全部摄取,没有对叶片组织的氧化还原状态产生明显的影响,因而最大限度的降低了基因在此过程中的作用,所以可以看出,正是由于这种取食方式上的不同,基因的沉默给烟草的抗虫能力带来了截然不同的结果。经过以上的讨论,我们可以得出基因的沉默影响了烟草针对刺吸式昆虫的防御机制,这种影响是因为刺吸式昆虫或是通过引入病原菌,或是自身能够刺激叶片产生活性氧的积累而使得烟草处于一种氧化胁迫的状态下,而基因的沉默降低了烟草对氧化胁迫的耐受的能力,导致了的大量积累抑制了调控的下游防御反应,造成了相关次生代谢产物的下

122、降,而使得植物防御能力减弱。n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究第四部分交替氧化酶在烟草针对番茄非致病型丁香假单胞杆菌防御机制中功能的研究基因的表达除了被机械损伤、低温等逆境胁迫诱导外,相关研究表明也能够通过未知的机制调节该基因的表达。在被处理的烟草细胞悬浮系和烟草叶片中均发现有蛋白的增加五,,,而与植物抗病原菌的系统抗性有着密切的关系,一度人们曾认为就是在植物组织中传递的信号分子,,,,。后来人们发现,在植物抗病的过程中基因同时也能被诱导表达,不过等人在用番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染拟南芥却发现,在植物中基因同样还是被诱导表达了

123、。因为植物分泌一种源自细菌的蛋白能够水解水杨酸成为儿茶酚,所以他们认为在植物与病原菌互作过程中的表达是不依赖于的,。而同时在应用突变体时,发现基因的转录被抑制了,因此推测植物在与病原菌互作过程中的基因的转录依赖于乙烯的信号途径。另一个关于基因可能参与到植物抗病原物的研究是关于烟草和病毒互作体系的实验,等发现基因参与到了调节的超敏反应相关的细胞程序性死亡过程中,但是基因的缺失和过表达并没有影响植物抗病毒的能力,。在前面的两部分里,我们对基因在烟草针对咀嚼式昆虫和刺吸式昆虫的防御机制中的作用进行了系统的描述。发现基因转录的沉默并没有影响到烟草防御烟草天蛾幼虫的能力,但是

124、却降低了其对刺吸式昆虫小绿叶蝉的防御能力,这体现在转基因植物叶片上出现大量的损伤面积和较低的防御性次生代谢产物的积累。我们推测这可能跟烟草与小绿叶蝉的互作过程中有大量的积累有关。综合分析现有的实验结果,显然烟草与小绿叶蝉的互作过程与植物和病原菌互作过程有着惊人的相似处,比如在叶片中的积累和细胞坏死等表型,那么这是否与刺吸式昆虫在侵染时携带病原物感染植物有关呢虽然我们还未能分离出该昆虫侵染植物时所携带的病原物,但是这里我们用番茄非致病型丁香假单胞杆菌来侵染烟草,通过观察在非亲和互作过程中基因的沉默是否对烟草抗病能力有所影响,希望能以此来对烟草和小绿叶蝉的互作体系的研究

125、进行有益的补充,并完善人们对基因在植物抗病虫害功能方面的认识。材料和方法n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研究植物材料的培养烟草为第代自交品系,种子采自美国犹他洲野生种群,所有转基因,以及野生型供试植株均来自该品系。植物材料种子消毒和萌发同第一部分。烟草与番茄非致病型丁香假单胞杆菌的互作实验番茄非致病型丁香假单胞杆菌培养依照兀,的方法配置儿"培养基,各种成份如下叩型蛋白膝由中刀认丙叨岁岁及仇酬岁一脚,刃姗脚培养基灭菌后过滤加入原液,并加入抗生素利福平形几林留和四环素丁℃林留血。从甘油管中画线将菌种接入培养基中℃培养过夜。在实

126、验前挑选单菌落接入一的加有两种抗生素的液体培养基刃加一中一,℃过夜培养。然后一印离心并重悬在溶液中,待用。烟草与番茄非致病型丁香假单胞杆菌互作的实验将菌液浓度用溶液调整至护,选择莲座期植物叶片用无针头的注射器将菌液注入叶片,并以注入溶液为对照组。将注入叶片区域用记号笔标记下来,后根据不同实验目的进行采样。测定植物抗菌能力的菌落形成实验需要在注入菌后的小时、天、天后采样,用打孔器在注射区域采集叶盘,并在川的溶液中进行研磨,稀释一定浓度后取川点在加有两种抗生素的固体培养基上℃培养过夜,而后对形成的菌落进行计数,并最终计算单位面积叶片内菌落的形成数量。以此比较植物的抗菌能

127、力。烟草细胞坏死的毛叮染色和离子渗漏的测定竹即染色配置肠即母液苯酚,甘油,乳酸,水和冲,染色液为母液与乙醇混合。脱色液为水合三氯乙醛溶解在水中。将需要染色的叶片浸没在染色液中,并在水浴中煮分钟连续染色过夜,第二天用脱色液进行脱色,直到洗脱背景。离子渗漏参照。,的方法,在接种番茄非致病型丁香假单胞杆菌后,一天内连续采样,选定在菌液注射区域用打孔器打下片叶盘,然后再将叶盘放入装有去离子水的塑料试管中,帅订室温下培养个小时,然后用电导仪,耐测量溶液的电导率。。提取以及基因转录水平的荧光定量测定同第一部分。n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研

128、究烟草叶片中植物激素的测定同第一部分烟草叶片中过氧化氢的染色和试剂盒测定染色方法修改自五。川,的方法,配置岁的一,的染色液,即洲从巧叨将接入病原菌的需要染色观察的叶片从叶柄处分离,并插入到染色液中,温育小时让叶片充分吸收染色液,而后将叶片放入的乙醇中煮分钟脱色,而后储存在的乙醇溶液中用显微镜观察。试剂盒检测叶片中过氧化氢在液氮中研磨采集的处理叶片,称量并在的助管中分装的样品,而后加入川的和的活性碳进行提取,首先振荡然后放置在冰上伽。而后预冷离心机,℃离心伽叮。最后用上清液进行测定,测定步骤参照玩试剂盒仰刃认邢叨进行。具体的,取川样品用试剂盒中的反应缓冲液川中和样品,

129、取出上样到孔板内。将按照说明配置的反应液伪叮原液,伽袱原液,反应缓冲液取,加入孔板内,避光室温分钟后用酶标仪读数,激发波长,检测波长。最后根据过氧化氢的标准曲线,计算样品中过氧化氢的含量。烟草叶片中次生代谢产物的测定同第一部分实验结果与分析番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染对烟草叶片的损害n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究野生型和让植物的照片。心别旧母竹越笋用姆考口份花以让口在对野生型和植株接种了番茄非致病型丁香假单胞杆菌后比较直观的一个表型就是,在植物中较早的出现了细胞坏死,图为野生型和气植物在注射了约、浓度的菌液后第二天的照片,可

130、以清晰的看到转基因植株中较为明显的细胞坏死。番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染烟草后叶片的细胞坏死之行缺叹刊n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和杭病机制中功能的研究只尹初日口名叮长工妇山二︶口吕︵。勺卜之妇二`。﹄一之妇臼号卜之巴`﹄图番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染烟草后叶片的细胞坏死。图为番茄非致病丁香假单胞杆菌接种后一天野生型和植物叶片的照片。图为对番茄非致病丁香假单胞杆菌接种后一天野生型和植物叶片的即染色照片。图柱状图为番茄非致病丁香假单胞杆菌接种后一小时野生型和植物叶片离子渗漏的生物学重复平均数,样品取自个不同的生物学重复。图柱状图为荧光定量测定的

131、烟草基因转录相对丰度的生物学重复平均数。样品取自对照和番茄非致病丁香假单胞杆菌接种后一小时野生型和植物,独立个不同的生物学重复。星号代表在统计学检验差异,勿砂犷在夕份"n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研究砂竹尹毯吟份一乃甲剐砚一盯士洲刀农夕份一,件入乞月"、孑爸份殆这里我们进一步全面的对番茄非致病型丁香假单胞杆菌对烟草侵染引起的细胞坏死进行了观察。首先,图是对野生型和植物接种了一约护浓度的菌液后至天内的叶片照片,可以看到野生型和烟草在接入病原菌后第二天就开始出现了叶片细胞坏死的差别,并且表型随时间变得越来越明显。

132、可以看到植物在第二天就出现了明显的细胞坏死区域,表明基因的沉默使得植物在与病原菌互作过程中对细胞坏死的抑制能力被削弱了。图是对叶片进行的肠,染色同样证明了突变体植株的细胞坏死的加速,在第二天两个品系的植物叶片中坏死的细胞数量明显增多。因为植物细胞坏死伴随着细胞膜的裂解,这样胞质中大量的离子就会渗透出来。因此对叶片的离子渗漏测定也是一个说明细胞坏死程度的重要参数,我们对接入病菌的植物叶片区域进行采样,并将其浸入去离子水中,让叶盘内的离子充分释放出后测定水溶液的电导率,可以从图看到番茄非致病型丁香假单胞杆菌的侵染,使得叶片的离子渗漏现象加强并且随着时间逐步增加,而同时植

133、物的离子渗透都要高于野生型呈统计学检验的显著差异。最后,我们还从遗传学的角度证明了这个坏死的过程,通过的序列我们克隆了拟中同源的呷顶基因,这个基因是病原菌与植物互作过程中,与超敏反应相关的细胞程序性死亡的标记基因,它的转录调控与烟草细胞的细胞程序性死亡直接相关几。,。我们通过设计荧光定量的引物来测定了该基因的转录,与染色和离子渗透实验的测定结果一致该基因在病原菌侵染后的叶片中显著上调,并且同时在植物中转录的丰度远远高于在野生型中的表达。番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染烟草后基因的转录水平n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究招二一引妇﹄

134、翁三之加自狄叹川之舀伽图烟草基因转录对番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染的响应。图中柱状图为荧光定量测定的烟草基因转录相对丰度的生物学重复平均数。样品取自对照和病菌接种后、、、、、小时,各个独立的生物学重复。星号代表在统计学检验差异。入乞刁口尤矛啥夕份仕入吸注口万、份月七俪℃在确定了番茄非致病型丁香假单胞杆菌能在与烟草的非亲和互作过程中引起细胞程序性死亡之后,我们同样对基因转录水平在这一过程中的变化做了荧光定量测定。由图我们可以看到,在实验开始到小时内的早期样品和小时以后的样品中,基因的转录水平截然不同。与模拟虫咬实验结果类似,基因由于注射菌液的机械损伤效应在分钟内显著

135、上升,这是因为溶液对照和菌液注射的样品都在。。小时处有一个表达高峰但是并没有显著的差异。而从小时开始,注射菌液的样品基因转录开始逐渐升高,在小时和小时的样品中可以看出,基因转录一直维持在一个较高的水平这说明基因在病菌和植物互作的过程中被未知的作用机制而上调了,由于时间上与植物坏死的反应相吻合这暗示着蛋白可能参与到了病原菌诱导的植物的细胞程序死亡的过程中,并且的作用也应该是体现在植物和病原菌互作的后期过程当中。烟草叶片中番茄非致病型丁香假单胞杆菌菌落生长的生物学检验n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和杭病机制中功能的研究,卜·矛从袱一户从创壮扣二£·广一

136、二二二口三杆即图番茄非致病型丁香假单胞杆菌在野生型和烟草叶片中的生长。图中各点为番茄非致病型丁香假单胞杆菌在野生型和植物中到天内菌落生成的生物学重复平均数。样品取自个独立的植株尸份件划矛"摊笋份二上述实验结果的验证,说明了基因在烟草与番茄非致病型丁香假单胞杆菌互作过程中参与调节细胞程序性死亡的功能,那么基因的沉默是否也同样影响了植物的抗病能力呢为了阐述这个问题,我们对烟草叶片中的病原菌生长做了菌落形成的生物学检验,如图。可以看出单位面积叶片中病原菌的生长在接种小时候后基本保持一致,但是在小时后,植株中病原菌的数量有所下降。而在天后转基因植株中菌落的生长继续

137、下降表明超敏反应介导的程序性死亡,有效的降低了植物叶片中细菌的数量但是同时这也是以加速的细胞死亡为代价。所以在病菌接种的初期,植物并没有显示出抑制或者加速病原菌生长的表型,但是随着超敏反应的发生,细胞坏死开始有效的抑制叶片中病原菌的数量,使得植物中的病原菌数量开始减少。番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染烟草后叶片中过氧化氢的水平在植物与病原菌互作过程中一个重要的特征就是活性氧的爆发而活性氧的爆发被证明在作用上有着双重性质,当活性氧的积累在一定范围之内时,能够直接消灭病原菌并且作为一种信号分子来激活防御反应,但是当过量的活性氧积累的时候,则会引起自身细胞的程序性死亡。n

138、兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究记卜仍口侧陌心介一户从创住材食习卜碑了即而甲拍翻洲协·一夕阴创粗幻月耐峨扣一,亏让一。州一口口《n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究只州门二附赎璐泪映确一长倒坦村招,﹄`落映火`劝,洲枷的心之佑`图番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染烟草后叶片中的过氧化氢水平。图为番茄非致病丁香假单胞杆菌接种后一天野生型和植物染色的照片。图柱状图为番茄非致病丁香假单胞杆菌接种后一小时野生型和植物叶片过氧化氢含量的生物学重复平均数,样品取自个不同的生物学重复。图柱状图为荧光定量测定的烟草基因

139、转录相对丰度的生物学重复平均数。样品取自对照和番茄非致病丁香假单胞杆菌接种后一小时野生型和植物,独立个不同的生物学重复。星号代表在统计学检验差异,,刀“日$王刀尸乙一件刀一,士入乞"、妙月刀口份万在线粒体中一个重要的功能就是被认为能够,消耗电子呼吸传递链的过量还原性底物,防止泛醒被过份还原而产生活性氧、乞,。那么基因的沉默,是否能造成植物叶片在遭受病原菌侵染以后多余的过氧化氢积累呢我们从三个方面的实验来进行了验证。从图中可以看出,应用二氨基联苯对叶片注入菌液的区域进行染色,在病菌接入一天后逐渐开始出现了棕褐色,随着实验的进行这种棕褐色逐渐开始加深,可以看出

140、病原菌侵染刺激植物细胞产生了大量的过氧化氢,但由于该方法半定量的局限我们并没有通过染色看见在野生型和烟草中明显的差别,因此我们采用了更精确的方法来对植物中的过氧化氢进行定量。在由试剂盒测定的植物叶片组织中过氧化氢的含量可以看出,在病原菌n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究侵染后的小时野生型和植物叶片内的过氧化氢水平并没有明显的区别见图,但是在坏死出现后的第二天,植物中的过氧化氢水平升高十分明显高出野生型倍,而在采样的最后一天过氧化氢的含量又急剧下降,这可能是由于叶面已经大面积坏死组织中的过氧化氢也逐渐被分解。而的深色染色结果则可能是

141、由于染色时需要使溶液渗入叶片一段时间内,而染色结果代表着这段时间内过氧化氢的积累。在植物和病菌互作过程中,质膜上的一是产生活性氧的关键蛋白,在拟南芥中证明,,两个基因调控的一的表达在植物与病原菌互作,特别是超敏反应相关的细胞程序性死亡机制中活性氧的释放启到关键作用。因此,我们根据近源的烟草汉中基因的序列克隆了爪的该基因,通过设计荧光定量的引物测定了该基因在接入番茄非致病型丁香假单胞杆菌后野生型和烟草中的表达情况,可以由图看出,在病菌侵染的一天内该基因转录开始上调,并且在烟草中表达丰度远远高于野生型的烟草。这表明基因在此过程中被诱导,结合过氧化氢测定的结果说明它可能参

142、与到这一过程当中并且与同时进行的细胞坏死密切相关。以上结果我们从过氧化氢定量,相关基因转录的测定等两个方面证实了,烟草在病原菌侵染的条件下,叶片内过氧化氢积累过量的事实,而且这可能跟基因的上调相关。说明基因对维持植物细胞在与病原菌互作条件下氧化还原平衡状态的重要性,而由于基因沉默所造成的过量活性氧的爆发则很有可能是加速细胞坏死表型的诱因。番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染烟草后植物激素和八公尸目基因转录的测定在对病原菌侵染后的烟草叶片植物激素的测定中可以看到,病原菌的侵染使植物叶片的升高,在接种的第一天,野生型和叶片中都维持在岁的水平,但是在第二天时,烟草叶片中仍维持原

143、有水平,而在野生型烟草中的水平开始逐渐下降,到第三天的样品差别最为明显,可以看到烟草中的含量是野生型中的一倍如图,这说明了积累跟这两种基因型植物表现出的坏死表型有着内在的联系。更为有趣的是对于水平的测定,在未处理的叶片中水平保持不变,而在病原菌诱导的叶片,可以看到截然相反的趋势,野生型中水平的逐渐升高,而在植物中在逐渐降低,这不但表明了两种植物激素的互相抑制的关系,还暗示着在植物细胞程序性死亡的过程中,两种激素协同作用的机制。n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究只州力洲铡姗。〔习帆厅留留月叻心必仁曰有映大邹,矍翻爵月·比俨︶︵口动,

144、比︵︶口哎仍的喊矍伽泌·丫、徽,廖廖、尸︵`口︶挂护动口,图番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染烟草后的激素水平。图中柱状图为激素含量的生物学重复平均数。样品取自、、、小时后对照和番茄非致病丁香假单胞杆菌侵染处理的个不同植株。星号代表在统计学检验差异。划刀份士、、、,,植物病原菌互作的过程中,大量的是如何产生的呢在对拟南芥的研究中发现,的生成来自苯丙氨酸代谢途径和异分支酸合成路径,而调节这两个途径的关键合成酶苯丙氨酸裂解酶和异分支酸合成酶是生物合成的关键蛋白。那么在中病原菌诱导的积累是通过哪条路径产生的呢通过对两个基因荧光定量的测定,我们发现队基因在这一过程中被上调如图。

145、番茄非致病丁香假单胞杆菌的侵染大大诱导了烟草中两个同源基因,的表达,在病菌侵染后的小时,植物中基因的转录远远高于植物,表明过量的来自于该途径。n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研究月`一甲竺协右工长七卜。长一之妇俐咤逻卜。﹄`﹄召召么一几币口犷减艰月曰月材县右扫刁决逻入。﹄长名召咤入几的。﹄。图烟草基因转录对番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染的响应。图中柱状图为荧光定量测定的烟草基因转录相对丰度的生物学重复平均数。样品取自对照和病菌接种后、、小时,各个独立的生物学重复。星号代表在统计学检验差异。入乞厂只五切仕入乞乃抚"、份贻番茄

146、非致病型丁香假单胞杆菌侵染烟草后叶片中植物次生代谢产物的水平对番茄非致病丁香假单胞杆菌侵染的相同样品进行了次生代谢产物的测定,如图、,可以看出病原菌的侵染并没有刺激尼古丁和芸香营的积累,在病菌处理前后这两种次生代谢产物的水平并没有发生变化。但是,图显示二菇糖贰在野生型中大量积累,特别是在接入病菌后的第三天,与植物呈显著的差异。此外,绿原酸的水平在野生型和植物中都有升高,但是在小时后植物积累的绿原酸量高过野生型的水平图。虽然所测定的次生代谢产物并非与烟草对病菌的防御有关,但是可以看到除了绿原酸外,其它成份大多或没有诱导或被抑制在一定水平,这说明了植物叶片内过高的n兰

147、州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研究含量所造成的对信号途径下游相关的次生代谢产物的抑制作用。只州力二孟絮甘盆共映,考盆卜︵﹂口︶考名,佗门︶。八甘︸四甘自臼︸臼尸口,比口二一乞一工书仁︸”﹃︸丹﹃﹄︸八甘匕尸考比材︵伪︶考习比﹂口加“︸,一二考﹂︶。,考一二︵﹀﹂口日。n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和杭病机制中功能的研究图番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染烟草后次生代谢产物的水平。图中柱状图为次生代谢产物含量的生物学重复平均数。样品取自、、小时后对照和番茄非致病丁香假单胞杆菌侵染处理的个不同植株。星号代表在统计学检验差异。功

148、仕、、刀认几,讨论这一部份我们从烟草和番茄非致病型丁香假单胞杆菌的互作体系的研究中逐步完善了我们对基因在植物抗虫、抗病机制中作用的认识。由于我们发现,烟草对小绿叶蝉的防御反应部份依赖于路径的,而基因在这个防御机制当中发挥了重要作用。从各方面的实验结果来看,、、三者存在着紧密的联系,它们的共同作用影响了植物防御机制的运行。而显然受限于烟草和小绿叶蝉这个不太成熟的研究体系,我们不能很好的探讨三者之间的关系,关于烟草和番茄非致病型丁香假单胞杆菌的研究则能很好的弥补这点。其实,这方面的研究在关于拟南芥的研究中就曾报道过,用番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染拟南芥后就发现,病原菌

149、的侵染诱导了基因的转录以及蛋白的表达并且发现这种基因的转录调控不依赖于信号途径,并且基因的转录调控发生在植物病原菌互作的后期。,。我们在关于番茄非致病型丁香假单胞杆菌侵染诱导烟草基因表达的实验里也得到了相同的结论,即在接入病菌的短时间内并没有引起该基因的表达,而是当病菌侵染的小时候后该基因被强烈诱导。另外,关于烟草和病毒互作体系中,人们发现基因参与到了调节的超敏反应和相关的细胞程序性死亡过程中,过表达基因能够有效的抑制相关的细胞程序性死亡,但是基因的缺失和过表达并没有影响植物抗病毒的能力,。同样在我们的研究中也发现,对基因的沉默,使得烟草的反应加快了图、,由于较快的

150、反应使得病原菌数量下降图,这说明基因的沉默间接的影响了烟草的抗菌能力。那么为什么基因的缺失会造成烟草细胞程序性死亡加快呢我们从检测被侵染组织的过氧化氢和植物激素入手,发现植物在被病原菌侵染后组织内的转录被上调以及过氧化氢水平升高图,而且还伴随有大量的的积累和基因的转录的上调图、,同时也抑制了的生成。而和过氧化氢无疑是引起植物细胞过程十分相关的信号分子,例如向植物细胞外源的添加过氧化氢,最终会导致植物的细胞程序性死亡。,丽。,。而向烟草的基因缺失突变体添加,会让整个细胞的呼吸阻断,并伴随有n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究细胞色素的

151、释放引起细胞的反应。记,。这说明了、过氧化氢和之间的确存在的一个相互调节的关系,这使得在植物调控自身反应过程中的作用变得更为突出。最后关于次生代谢产物的测定,我看到在植物中大部分信号途径相关的次生代谢产物如尼古丁,咖啡多胺都没有发生任何变化,而二菇糖贰在野生型中积累但在植物中被抑制这些都说明,当叶片内过量积累后对调控的次生代谢产物合成的抑制。结合烟草与小绿叶蝉的互作实验就不难发现,烟草同样出现了叶片大面积坏死,叶片内积累升高并且信号调节的下游次生代谢产物的合成也被抑制,这些惊人的相似点表明了小绿叶蝉侵染植物与病原菌侵染植物的共性,也进一步印证了我们关于小绿叶蝉这种刺

152、吸式昆虫可能在与植物互作时携带病原菌侵染植物的推断。当然,更确凿的实验证据,需要我们进一步对小绿叶蝉侵染过后的叶片中病原菌和其唾液进行分离收集,再对植物进行处理实验进而全面的得出结论。但总而言之,本部分对烟草针对番茄非致病型丁香假单胞杆菌防御机制的研究,无疑可以更清晰的说明基因在植物对刺吸式昆虫、病原菌这类与信号途径、非常相关的防御反应中的功能。n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研究第五部分结论立足于国内外关于基因研究的最新进展和本实验室关于抗氰交替呼吸途径在一系列植物抗逆境机制中功能的研究基础。综合昆虫唾液诱导烟草的数据和二点叶蜗侵

153、害能够诱导植物抗氰交替呼吸途径变化的实验数据,我们提出了基因可能参与到了植物对昆虫的防御机制当中的假设。为了检验这个科学假设,我们进一步构建了烟草的基因沉默植株,因为沉默或过表达某个基因的遗传学方法一直是证明该基因功能的有效手段。我们预期在沉默基因后,会给烟草的抗虫能力带来影响,通过设计相关实验得到如下结论在烟草与烟草天蛾幼虫的互作过程中,基因被昆虫啃咬和唾液强烈诱导表达,但是这个基因的沉默并没有影响烟草的实际抗虫能力。具体体现在如下三个方面首先,基因的沉默没有影响昆虫侵害刺激烟草产生的和一含量的变化,而和一是调节植物防御昆虫的重要激素,它们积累量的多少直接决定着植

154、物抗虫能力的强弱其次,虽然是植物线粒体上调节线粒体呼吸代谢的关键蛋白,但是沉默该基因后并没有影响到烟草防御性次生代谢产物尼古丁、二菇糖贰等的积累最后,实际的虫咬实验中基因沉默也没有影响昆虫取食植物后虫体重量的变化,这说明该基因没有影响植物的抗虫能力的同时也没有影响到昆虫对植物组织中营养成份的摄取。虽然在烟草与咀嚼式昆虫烟草天鹅幼虫的互作实验中,烟草没有表现出对昆虫防御能力的变化,但是在野外实验中我们发现了一种刺吸式昆虫一小绿叶蝉,它对烟草造成更为严重的侵害。这说明了之前烟草和烟草天蛾幼虫研究结果的单一性,启发我们需要在新的互作背景下考量基因调节植物抗虫能力的作用。为

155、此,我们在温室中进行了一系列关于烟草和小绿叶蝉的互作实验。与烟草和烟草天蛾幼虫的互作模型一样,小绿叶蝉的侵染强烈诱导了植物基因的表达,所不同的是在烟草叶片上,小绿叶蝉带来了更大的侵染面积,这与我们野外实验的结果相吻合。关于烟草叶片的植物激素测定和次生代谢产物的测定,让我们进一步了解到植物抗小绿叶蝉能力下降的原因。首先,在烟草中植物激素积累量远远超过了野生型植株其次,所有调节的次生代谢产物的含量都没有变化只是维持在基本水平。相反,在野生型中这些次生代谢产物却大量积累,从植物激素信号互作的常识我们知道的大量积累会抑制的生物合成以及调节的下游信号途径。在紧接着的实验里我们

156、考察了尼古丁、咖啡多胺、二菇糖贰这三个代谢产物在烟草抵御小绿叶蝉机制中的作用,应用了n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究相关生物合成基因的沉默植株、、,在分别降低这三个成份的背景下与野生型和生物合成相关基因沉默的烟草进行了对比,我们所得到的结果是,尼古丁是烟草对抗小绿叶蝉的关键物质,因为在烟草中叶片被损害的最为严重。而在烟草中也有着相似的虫害表型,表明了整个防御体系对信号途径的依赖。所以可以看出不同于烟草天蛾,小绿叶蝉能够通过刺激叶片中的积累来抑制烟草对它的防御反应,而当烟草不能表达基因时的积累量升高更为明显,这也是为什么烟草有更为

157、严重的虫害表型的原因。那么是什么原因使得植物中的积累过量了呢参阅人们以往对植物和刺吸式昆虫的研究结果,发现这类昆虫能引起植物类似与病原菌互作时的特征,因为刺吸式昆虫被证明能够作为病原物的载体在侵害植物的同时也给植物传播了病菌。而实验中我们得到的升高和植物叶片出现细胞坏死的结果,也与植物与病原菌互作的过程很接近。所以,我们又继续对植物与病原菌的互作进行了考察,期望以此来一定程度上完善我们的研究。在烟草与番茄非致病型丁香假单胞杆菌的互作实验里,病原菌的侵染使烟草较早的出现了细胞程序性死亡,并且在接种后的第二天开始诱导产生了大量的,并伴有过量的过氧化氢积累,由于和过氧化氢

158、都被证明与植物细胞程序性死亡机制相关,因此我们推测这是植物较早出现细胞程序性死亡的原因,当然更直接的证据,需要用和过氧化氢生物合成缺陷的转基因植株来进一步证明。不过,对比的看植物与病原菌互作和与小绿叶蝉的互作实验,我们不难发现对基因转录的沉默在两种背景下,得到了十分相似的结果即在互作过程中都伴随着叶片大面积的坏死和的升高。这证明了基因与存在相互调节的关系,并且根据过氧化氢的测定,植物中过量的过氧化氢也很有可能是积累的原因,因为过氧化氢被证明能够上调苯丙氨酸代谢途径中酶的活性来促进的生物合成,这与在植物中基因的转录被上调的测定结果相吻合。综合三个互作系统的实验结果,我

159、们可以清晰的看到这样一条脉络,基因参与到植物防御系统的过程是与调节的信号通路密切相关的,基因的沉默反馈调节了的生物合成,而这个机制可能是通过过氧化氢过量积累来诱导苯丙氨酸代谢途径实现的。所以,在所有与相关的防御体系中,基因的沉默就给植物带来了巨大的影响,这体现在对刺吸式昆虫和病原菌的防御中,首先互作初期的生成会抑制线粒体中电子呼吸传递链的运行,这时正常细胞能够表达来消耗堆积在泛酮处的电子,避免泛醒的过还原状态而引起超氧阴离子的产生从而生成过氧化氢,反之对的沉默则加速了这个过程如图。胞内过氧化氢过量积累又会进一步的去刺激苯丙氨酸代谢途径,使的n兰州大学博士学位毕业论

160、文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研究不断积累抑制了信号途径调节的次生代谢产物的生成而这直接使植物抗虫能力下咀嚼式昆虫刺吸式昆虫病原菌骊…渊黝蘸黝图在植物针对咀嚼式昆虫、刺吸式昆虫和病原菌的防御机制中的角色。一、一降,其次过量的和过氧化氢的积累还可以直接导致植物细胞的坏死加速,这使得乙气烟草叶片在被小绿叶蝉和病菌侵染后出现了大面积坏死区域。以上的研究结论无疑加深了我们对在植物针对病虫害防御机制中作用的认识,更突出了线粒体在这一过程中的特殊作用,由于线粒体的电子呼吸传递链与糖酵解和循环的紧密联系,我们知道任何细胞代谢水平的变化如一些初级代谢产物浓度的变化或者比率

161、的变化,就会改变线粒体电子呼吸传递链的运行状态。比如丙酮酸,柠檬酸就被证明能直接调节基因转录和蛋白的活性功,,,。显然,病虫害侵染所带来的细胞生理水平的巨变同样会改变线粒体内部的呼吸代谢状况,我们知道线粒体基因能够编码自身的部分蛋白但基因则是由细胞核调控转录的,那么在植物细胞遭受到外界病虫害侵害后,是什么信号从线粒体传递到了细胞核而指导了基因的表达呢根据线粒体倒置理论过氧化氢等一类小分子似乎在充当第二信使的作用,,通过我们的研究也可以看出和过氧化氢在这一过程中都起到了极其重要的作用,而揭开整个信号网络的面纱,也鱼待相关研究工作的进一步展开。n兰州大学博士学位毕业论

162、文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研究参考文献,,,,,,,,一,,,,,为阴一恻冲,并,,抉沙一一劫,,妙一户即一玩一,山心一户,,,一井,,,,,力,一】加一,,,,,一一,,,,,一,,,一,,一,丫一一勿一,一一,,、,,一,,,,,一,一,,一,川一一,盯,,,,卫`叩细一一n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究卫一,,,恤一盯,,,一玩一,币一,,,,,,,,一,帅一,,,,一丫一,,,,,,一,一,,,,科一咖,砍,盯,一即一,,,到免一一,,,,,,,一一一,月七,,,一,一,七凡一,一,,面,,一,,…,,,,

163、,,,,一,,,一,娜,一,,一,,,,明,,,,,,,一叩户一,,,,,,一一,,一一一n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究一并,,,,一一,,,,,,叩灿一一,,,,,,脚一,,,,,沙一,,,一,,,,,,,即,一罗为一,,,,,,,,一比一,,,,,,,,一,,,,,面一,,,,,,一一,帅一”一一,,,,恤一,,,八一,,一,,】,,,,,,,,,勿并,,,,,一长万并,,,,,一一,,,,,,玩,耳n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究,一·九阴一,,,,,,,滋恤加一一,一一,死一,,笼

164、招一,,,,幼,,,,,,,,一,,,,,即并,,从飞,面一一,刀一一,长,,仃刀,户一一一,,,,刀,一一一,,,,,一一派场一,,一即户一,一一,,,哟,,,,一弹,一,一面们一,」一一,,,,一一舰一一,,,,七n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研究一,,,并,一,一一,一,,,,一一,且一,,,一,加一并,七,,,一面一滋一一叱一滋,,试,卫湃一一一滋,,,,一滋,,长,,,一一一,,,,一,,,,一,,一,一一,一,一"一,,一芍,一场叹一,,滋雨长,,长,一一,,,,,一n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟

165、草抗虫和杭病机制中功能的研究一一,,田旧,长,,”一,一,一一枪,,,,,户,,耐一,启一肠,滋,八,即·一,,,,一,粗,呷一一一,,一一£,,一,,,二一,,,,一冲并,,,一,,,,的一,,,,,,,一,一,一,一一,一』一笼,,,,,,,一,,,,一一,如一一,,,一一一一,一一n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研究翻"一,朴一,,,仰一一,一一一,勿一,滋,,,血,习一议一,,,,一,,长,,一,,,,,户一一,,,橄一,,一一,长,,,一,,“一玩一,,”一,一一加一,,,一一,户一,,,丫一币,,,,,,,,,

166、一,,一”,,一一,,,,一n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究,,一,,,一五,面一,一,,长一一,,,七一,加一,,一,,面哪即,一一,一长,万助一,,,,一一一一,,一一一,,一一,,,,一几动限,一,改币,一明刃一一,一,,勿一一,,,,印一,,叭,一能一一,一一,,州一卿,,,,,粼一丫,n兰,大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研究,,,七八一助,一一叭一灿,面一助,,,,,一一一,,,,,一一,,,一,,,如,鱿,,一,即·一,,,,,一坤一,,一,颧堪,,,,,,,”一,,,一犯,一,,一时一

167、一,,一,,,,一,,一一一一,一一一一一,,,扣一,,,,,,,,,,,,一万一一一n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究比,妙,`万户一,鱿”。卫们。一凡顽,,,,加笼一,由,别叮,,”,七万一价湘一冲招五一,,劝,,,,,功曲叨刀而贝一,,,忱,,,田卫田叮,一,而一幻口一,,,,田旧万一一公,而,,,卜刀一而面一,,,一,一一,,,,,,〔。,,幻一一,,,,,,如勿一口,,恤,一,,,哪珍州一一,,此讨,印,而,田叭一,,并℃,,七。代月一,,氏一一一,加一刃叨一,沙面一n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病

168、机制中功能的研究吟一·一,,汀,,面月姆一扣”咖一,盯叩一,九叻一雌少,,一一,面一,。叭】,的,,,,,,,,此四,,,,从飞,,,,一,,,而一,,为,代沮,一一,,,面,,,一一沈一,七比一一一沙一,一由,,印一,,五,,,几邓初由一,,盯沙一,,,,,,一,叭,,一,,,一,,,,户一一,,助,议,,,,,一户一,,一一,,,,,,田卫一,,n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究,,灿妞”介一,切,,滋,滋匕,,,均切叮一,租卫一七,,,,万即别叮绍一一,,,件吵一礴钦俊德,昆虫与植物的关系。生物学通报一何军贤,韦振泉,林宏辉

169、,梁厚果水分胁迫对小麦幼苗抗氰呼吸和交替氧化酶基因表达的影响。植物学报一李红玉,周功克,胡铁强,孟雪琴,万东石,沈喜,毕玉蓉,郭进魁,梁厚果,张立新抗氰交替呼吸途径参与马铃薯软腐病菌对马铃薯块茎的侵染。西北植物学报一n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草抗虫和抗病机制中功能的研究附录表荧光定量相关引物序列基因名称正向引物"一"反向引物"一"已扭,飞,,,,,`"一"注几探针序列为二",,,n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究图烟草。厅`口血和基因序列的比对。

170、图中黑色背景为相同的核昔酸汽入加目幻朋加习田白献水扭口恤姗翻困目峨日目匆困一四一口一艰一肠旧润巨日沼洲阅翻翻四口洲留四时口日月白入困四圈目目目目皿睡国皿产栩犯电困困困困目匆翻翻匆口口匆匆圈目目仑仓石石日目妇盛圈峨翻主砚旧二目嗡即脚嘀匆对翻皿翻益翻目公峨润展曰卿扣峨圈士艳目月恤目祠扣肠哪皿颐峨娜盆口左日肠龙口五口口曰皿目目成目日月日日碑口口吐七月口口甘口圈日吸圈口口日目画口或目峨目目口目睡四口绝目盆虽口虽爪口〕碑圈困曰谈口皿口皿相哪执妇泣曰困盛国面能口拍成曰拍盛母入仑仑入取入。目班圈或口口盆口口笼口目口口盆噶姐餐目喝电电噶一。以麦适魂娜砚睡匆黔。绷二黔压阵目调攫一七啡

171、浓七切够七口七仑一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一七七七七一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一日n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和杭病机制中功能的研究致谢回首博士三年,感慨万千,一路走来自己的成长与每一位关心和帮助过我的老师、同学都密不可分。在这里我向你们致以我最衷心的感谢。感谢我的导师李红玉教授从硕士到博士多年来对我的指导和帮助,指引我一步步在科研的道路上走向成熟。我今天所取得的成绩与李老师对我的付出密不可分。平日里李老师在为人和生活等方方面面对我的熏陶和关心,更是让我受益匪浅。恩师那句“学学

172、问,要先学作人”的谆谆教诲,让我时刻铭记于心。感谢德国化学生态研究所的教授,作为我的德方指导教授,他对我博士论文的实验工作也是细心指导、严格要求。特别是在百忙之中,常跟我讨论课题进展,给予指导和帮助,让我得以在有限的时间内完成对本论文课题的研究。感谢父母多年来的养育之恩和在学业方面对我无私的投入和支持。感谢所有兰州大学的同学、挚友及在德国研究所共同工作过的同事们,谢谢你们一直以来对我的帮助和支持。n兰州大学博士学位毕业论文交替氧化酶在烟草杭虫和抗病机制中功能的研究研究成果,幻,,一权犷一,,,日,张璐,李红玉,魏玉辉、检测砂生槐种子中的生物碱,药物分析杂志,一张璐

173、,李红玉砂生槐总碱水乳及微乳剂农药的研制,农药,一李红玉,张璐砂生槐生物碱水乳剂与微乳剂的制备及应用,发明专利申请号

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