基因工程制胰岛素(生工版).ppt

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1、用基因工程方法获得胰岛素第四组2021/7/291胰岛素是由胰岛B细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性胰岛素主要用来糖尿病治疗。胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因子具有高度生物活性，分子量很大，立体结构异常复杂，体外难以人工合成。所以过去糖尿病患者只能服用从牛、猪体中提取的胰岛素来治疗；但牛、猪胰岛素结构上与人胰岛素有差别，如与猪胰岛素B链第30个氨基酸残基不同，长期服用会引起肾和眼的疾病，故必需要用基因工程方法获得重组人胰岛素进行治疗。2021

2、/7/292基因工程制胰岛素三种方法一、A链和B链分别表达法化学合成A链和B链的编码序列2021/7/293基因工程制胰岛素三种方法一、A链和B链分别表达法表达产物的后期处理路线：2021/7/294基因工程制胰岛素三种方法二、人胰岛素原表达法基因工程菌的构建战略：2021/7/295基因工程制胰岛素三种方法二、人胰岛素原表达法表达产物的后期处理路线：2021/7/296基因工程制胰岛素三种方法三、A链和B链同时表达法2021/7/297方法一：由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有10%-20%，因此成本高。方法二：胰岛素原能形成良

3、好的空间构象，三对二硫键的正确配对率提高，折叠率高。工艺路线依然繁琐。方法三：需体外折叠。基因工程制胰岛素三种方法三种方法比较：2021/7/298基因工程获取胰岛素的步骤一、获取外源目的基因片段二、选择与获取表达载体三、重组目的DNA片段与表达载体四、选择与获取表达细胞五、重组体导入表达细胞六、对重组体细胞进行筛选纯化鉴定七、工程菌产物鉴定和保存八、发酵培养2021/7/299一、获取外源目的基因片段1．选择实验材料2．提取RNA，分离RNA3．逆转录mRNA,得cDNA第一链4．得双链DNA5．DNA序列纠错6.目的基因通过细胞克隆扩增7.目的基因回收及DNA测序，最

4、终目的基因获取2021/7/2910一、获取外源目的基因片段1．选择实验材料胰岛素是一种蛋白质类激素，体内胰岛素是胰岛B细胞（即胰岛β细胞）受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的。胰岛素基因只有在胰岛B细胞中才能转录出信使RNA，所以用基因工程方法生产胰岛素时，选用胰岛B细胞为获取目的基因的实验材料。2021/7/2911一、获取外源目的基因片段2．提取RNA，分离RNA2．1总RNA的提取2．2mRNA的纯化2．3mRNA的保存2021/7/2912一、获取外源目的基因片段2．1总RNA的提取总RNA的抽提方法有多种，TRIzol试

5、剂是使用组广泛的RNA抽提试剂，主要由苯酚和异硫氰酸胍组成，可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。提取RNA时，首先用液氮研磨材料，匀浆，加入TRIzol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分。然后加入氯仿抽提，离心，分离水相和有机相，收集含有RNA的水相，

6、通过异丙醇沉淀，可获得比较纯的总RNA，用于下一步mRNA的纯化。2021/7/2913一、获取外源目的基因片段2．1．1TRIzol法提取流程（1）样品处理①培养细胞：收获细胞1-5*10^7，移入1.5ml离心管中，加入1mlTRIzol，混匀，室温静置5min。②组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1mlTRIzol充分匀浆，室温静置5min。（2）加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。（3）4℃离心，12000g*15min，取上清液。（4）加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10mi

7、n。（5）4℃离心，12000g*10min，弃上清液。（6）加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g*5min，弃上清液。（7）晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。2021/7/2914一、获取外源目的基因片段2．1．1TRIzol法提取流程图2021/7/2915一、获取外源目的基因片段2．2mRNA的纯化该方法利用mRNA 3＇端含有PolyA（多聚腺苷酸）的特点，当RNA流经寡聚dT纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性的结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA