基因表达载体的构建.ppt

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1、第六章      外源基因在大肠杆菌中的表达调控第一节       基因表达的概述和基本条件第二节       在大肠杆菌中影响外源基因表达的因素第一节       基因表达的概述和基本条件一、基因表达的基本概念二、基因表达的基本条件三、真核基因在原核细胞中表达及调控第二节       在大肠杆菌中影响外源基因表达的因素一、启动子结构对表达效率的影响二、表达载体的选择三、外源基因（cDNA）中密码子的作用四、mRNA的一级结构与基因表达五、mRNA的二级结构对翻译起始的影响六、mRNA稳定性的影响七、转录终止区对外源基因表达效率的

2、影响八、转录后的若干因素与基因表达的关系九、宿主选择对表达的影响十、培养条件的控制对表达效率的影响一、基因表达的基本概念生物体的遗传信息都是以核苷酸序列编码的形式储存在遗传物质DNA上,基因表达是目的基因DNA在导入的细胞内转录成mRNA,再以mRNA指导翻译成蛋白质。基因的表达依赖于有效的转录和mRNA的正确翻译以及翻译后的加工处理等各个环节的调节作用，其中转录最为关键，原核的基因表达过程和方式与真核细胞有显著不同。二、基因表达的基本条件1.外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框架。其遗传密码不得缺失、遗漏、或错位及错码。否

3、则会导致编码错误的蛋白质分子，特别是目的基因序列内部应不含两端酶切位点的识别序列。2.插入的外源基因必须放在原核的启动子控制之下，也就是使原核的RNA聚合酶能够识别插入的基因。3.外源基因必须能在大肠杆菌中进行有效转录（如无内含子），转录后的mRNA在菌体必须相当稳定，并且能有效地进行翻译，转译的蛋白分子在菌体内不致于受菌体蛋白酶的降解。三、真核基因在原核细胞中表达及调控真核基因在原核细胞中表达及调控的特点㈠有效转录及其调控元件㈡正确转译㈢原核表达载体的构建㈠有效转录及其调控元件1.RNA聚合酶2.启动子及其转录作用的启动（启动子

4、的概念、分类）3.转录作用的终止4.转录的弱化作用㈡正确转译1.起始密码子（intiqtioncodon,initiator）2.核糖体结合位点（RBS，又称SD序列）㈢原核表达载体的构建原核表达载体的构建的要求1.表达载体类型2.表达载体的举例3.包涵体表达载体启动子⑴乳糖启动子（Lac）⑵Trp启动子⑶Tac启动子⑷噬菌体的PL和PR启动子⑸脂蛋白启动子（LPP）启动子结构对表达效率的影响启动子-35区和-10区序列与通用转录序列一致，间距为17bp，大于17bp效果差，不同产物选用不同启动子，如尿激酶用ptac，IL2/2F

5、U-V用PRPL启动子效果好。表达载体的选择载体分子量不宜过大，以2.5-5.6kb为佳，高拷贝，不同产物选用不同类型表达载体。外源基因（cDNA）中密码子的作用细菌中基因表达对密码子有偏爱性，不偏爱的稀有密码子（AGA、AGG）表达效果差，特别当有AGA-AGG连续序列存在时表达效率低mRNA的一级结构与基因表达启始密码子：表达效率AUG>GUG>UUGSD序列：较长的效率高，如UAAGGAGG比AAGAA高三倍；SD序列与AUG间距一般6-12bp，4-10bp较佳，9bp最佳；SD序列的5’非翻译区，若有5’-UGAUCU，

6、则有增强作用。mRNA的二级结构对翻译起始的影响mRNA形成二级结构时，可产生茎环。若SD序列、AUG位于茎环内或发夹内，转译受抑制；在茎环外则有利于转译。见表6-1mRNA稳定性的影响REP序列可阻止mRNA降解，偏爱密码子也起保护作用。真核基因在原核细胞中表达及调控的特点只有一种RNA聚合酶以操纵子为单位来完成基因转录基因转录无RNA剪接功能因无核仁、核膜，核酸均为裸露的，转录与翻译是连续进行的转录产物在多聚核糖体上合成，同时合成多条肽链有特有SD序列，调控mRNA与核糖体有效结合和翻译的起始无糖基化功能RNA聚合酶原核细胞只

7、有一种RNA聚合酶，当其核心酶与σ因子结合，形成全酶后，才能识别DNA上的启动子进行转录。启动子的概念启动子是位于结构基因上游，转录起始调控所必需的一段DNA序列，内含-35区（与σ因子结合）和-10区（和核心酶结合）的保守序列。当启动子与全酶结合后可在+1转录起始点开始转录，如图6-1。转录作用的终止由转录终止子发挥作用，凡能使转录终止的有关的DNA的序列称终止子。强终止子：不依赖ρ因子发挥终止作用，回文序列中G/C配对多，有四个以上U，致使RNA聚合酶构象改变而终止转录。如图6-9,如图6-10弱终止子：依赖ρ因子发挥终止作用

8、。如图6-11转录的弱化作用转录的弱化作用使转录没有到达终止信号处而中途停止转录，使mRNA转录发生部分停止，而不是发生全部停止。起始密码子起始密码子是编码多肽链第一位氨基酸的密码子AUG（或ATG），编码甲硫氨酸（蛋氨酸）。在细菌中也有罕见的起始