无创产前技术.ppt

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1、无创产前胎儿DNA检测技术简介唐氏综合征47,XY,+2121-三体综合征，又称先天愚型或Down综合征，是小儿最为常见的常染色体畸变疾病。我国活产婴儿中21-三体综合征的发生率约为1/600～1/800，男女之比为3︰2，60%的患儿在胎儿早期即夭折流产。传统产前诊断技术无创产前诊断方法游离胎儿DNA胎儿细胞游离胎儿RNA孕妇外周血胎儿细胞（fetalcell）种类滋养层细胞、胎儿有核红细胞、胎儿淋巴细胞、胎儿粒细胞特点包含完整的胎儿基因组可反映胎儿全部遗传信息数目少，限制其应用于无创产前诊断游离胎儿DNACell-freefetal(cff)DNADennisLo卢煜明

2、特点：1含量是孕妇血液中胎儿细胞DNA的970倍2含量有一定的变化规律，妊娠第5周开始可以检测出胎儿游离DNA，随着孕周增加而增加，存在个体差异3分娩后短时间内消失，平均半衰期为16.3min（4-30min），2h后没法检出。ChrN:100Chr21:100理论模型正常胎儿21三体胎儿Descriptionofthecontents正常胎儿Chr11:2000Chr21:20001000基因等分/ml（含50等份的胎儿基因;950等份的母亲基因）ChrN:1900Chr21:1900ChrN:100Chr21:150母亲21三体胎儿ChrN:2000Chr21:2050统

3、计结果:T21>正常胎儿血浆技术流程末端修复加“A”尾接头连接文库制备（1天）LM-PCR上机测序报告发送数据分析上机测序和数据分析（2天）C-botDNA提取血浆分离样品处理（1天）血液采集DNA提取后质控收样质控文库质控数据质控结果审核医院血样采集血样寄送包装技术流程末端修复加“A”尾接头连接文库制备（1天）LM-PCR上机测序报告发送数据分析上机测序和数据分析（2天）C-botDNA提取血浆分离样品处理（1天）血液采集DNA提取后质控收样质控文库质控数据质控结果审核医院4℃，1600g10min4℃，16000g10min残留细胞取上清样品处理两步法分离血浆：-80保存

4、在样品制备过程中，具有以下任意一条不合格的，判定为不合格品：(1)血浆分离后存在明显的溶血；(2)分离后血浆体积未达到最低要求(要求大于1.2ml)；(3)血浆全部用于DNA提取后总量未达建库最低要求(30ng)；(4)DNA提取过程中，阴性对照可以检测到浓度。样品处理DNA提取使用微量样品基因组提取试剂盒(天根，DP316)进行血浆游离DNA提取技术流程末端修复加“A”尾接头连接文库制备（1天）LM-PCR上机测序报告发送数据分析上机测序和数据分析（2天）C-botDNA提取血浆分离样品处理（1天）血液采集DNA提取后质控收样质控文库质控数据质控结果审核末端修复和加“A”接

5、头连接TDNAinsert+PCRP5P7Index公用P1IndexPCRprimerDNAinsertP5P7IndexSP1SP2IdxSPP7P5PCR扩增2100检测片段大小文库质控电泳结果在文库制备过程中，具有以下任意一条不合格的，判定为不合格文库：(1)电泳检测后发现接头未连接；(2)电泳检测或2100检测后发现存在接头污染；(3)2100检测后发现文库片段大小不合格，文库主峰大小为290bp左右，次峰大小为450bp左右；(4)定量检测后，发现文库的浓度过低(浓度低于30ng/ul)文库不合格标准技术流程末端修复加“A”尾接头连接文库制备（1天）LM-PCR上

6、机测序报告发送数据分析上机测序和数据分析（2天）C-botDNA提取血浆分离样品处理（1天）血液采集DNA提取后质控收样质控文库质控数据质控结果审核将被打断成几百个碱基（或更短），并在两个末端加上接头(adapter)的基因片段按一定浓度进行稀释。将基因片段固定在芯片(FlowCell)上。由于芯片表面连接有一层单链引物(Primer)，经处理后的碱基片段与芯片上的引物进行互补连接，被“固定”在芯片上。引物扩增，以样品为亲本链，使芯片引物延长形成复制链。ClusterGenerationOHFlowCell接头diolP7P5dioldiol模板杂交dioldiol延长dio

7、ldiol变性碱基片段杂交剩下的复制链其一端“固定”在芯片上，另外一端随机和附近的另外一个引物互补，被“固定”住，形成“桥”(bridge)。形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在芯片表面进行扩增，形成双链。双链经变性成单链，再次形成桥，并作为下一轮扩增的模板继续扩增反应。反复若干轮扩增，每个单分子得到了大量扩增，成为单克隆“DNA簇群”。dioldiol1stcycle变性1stcycle退火dioldiol1stcycle延长dioldioldioldiol2ndcycle变性2ndcycle退火