病毒的细胞培养.ppt

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1、病毒的细胞培养一基本原理二细胞培养的基本概念三主要优点四培养实验用品的前期处理五培养细胞的生长方式及类型六细胞培养的实验步骤七病毒的细胞培养一基本原理通过机械解离或消化等方法将组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞，给与必要的生长条件。模拟体内生长环境，使其在体外能继续生长与增值。在长成致密单层细胞后，将病毒接种在细胞上，置于适当环境中进行培养，逐日观察细胞病变（CPE）待75%的细胞出现CPE后收获细胞，反复冻融3次，置-70℃保存备用。细胞培养的基本概念传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外

2、条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。二主要优点㈠研究的对象是活的细胞。㈡研究的条件可以人为的控制。㈢研究的样本，可以达到比较均一性。㈣研究的内容便于观察、检测和记录。㈤研究的范围比较广泛。㈥研究的费用相对较经济。三分类原代细胞培养传代细胞培养原代细胞培养概念：从供体获取组织细胞后在体外进行的首次培养。优点：生物学特性未发生很大变化，细胞染色体仍为二倍体，接近和反映体内生长特性，适合做药物测试、细胞分化及病毒学方面的实验缺点：传代次数较多细胞就会衰亡。传代细胞培养概念：原代细胞经过一系列传代，产生变异，转化为能够连续传代的细胞。传代细胞可以直接从肿瘤组织

3、获得，又可以通过人工驯化获得。常用的传代细胞：PK-15、IBRS-2、Vero、Marc-145、CHO、MDCK、CRFK、Hela等四培养实验用品的前期处理1.清洗和浸泡:(1)玻璃器皿(2)塑料器皿2.包装3.消毒：在组织细胞培养技术中，务必保证组织细胞在无微生物的条件下生长。4.细胞培养用液及培养基（液）:（1）水：蒸馏水、双蒸水，可高压除菌。（2）平衡盐溶液（PBS)：PH为7.2－7.4，不含钙镁离子，可高压除菌。（3）消化液:胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的浓度为0．25％，pH值7.2左右。需过滤除菌。EDTA液：常用浓度为0．02％，配制时采

4、用无Ca2+、Mg2+平衡盐液溶解，高压灭菌后即可使用。(4)培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析，易发生支原体污染合成培养基合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点

5、：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。血清中含有：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子③激素④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加10％血清．对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚．血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血清、

6、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟（5）丙酮酸钠、葡萄糖：是属碳水化合物的成分，是细胞生命的能量来源。（6）抗生素：最终浓度为青霉素100U／ml，链霉素100U／ml（青霉素为80万U／瓶，将其溶解于4ml三蒸水中，每升培养液中加人0.5ml；链霉素为100万U／瓶，将其溶解在5ml三蒸水中，每升培养液加0.5ml）。（7）冻存液：二甲基亚砜（8）细胞生长液：是用以维持细胞生长增殖的液体。其是配方：基础培养基80％－

7、90％血清10%双抗100u/ml（9）细胞维持液：用以维持细胞缓慢生长或不死的培养液。其是配方：基础培养基95％血清2％－5％双抗100u/ml五培养细胞的生长方式及类型㈠贴附生长型细胞必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态的细胞。㈡悬浮生长型细胞不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。每代贴附生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）贴附生长型细胞细胞培养常用的培养瓶、培养皿、6孔板、96孔板悬浮生长型细胞六细胞培养的实验步骤1原代细胞的培养以鸡胚成纤维细胞为例（1）取胚（

8、2）组织处理（3）消化（4）分装、培养（1）取胚选取9-11日龄S