结核斑点试验操作简要.doc

结核斑点试验操作简要.doc

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1、结核斑点试验操作步骤-21.先分离淋巴细胞一、每个病人标本准备15ml离心管2支,编号1#,2#。二、在1#管加3mlFicoll;2#加4ml血和3ml1640三、将2#管中液体7ml慢慢加入1#中(让血加在Ficoll上面),-18C1000g离心22min。四、将离心好的1#管中的淋巴细胞层由上向下慢慢吸取约5ml(尽量将细胞吸取干净),加入到新的15ml离心管中,并加1640至10ml,颠倒混匀后600g离心7min。18C五、离心后尽快倒掉上清,先加1ml1640培养液,吹打把细胞打开。再加16

2、40至10ml,混匀。六、350g离心7min。倒掉上清,加入500μlAIM-V培养液,震荡混匀。2.细胞计数及稀释七、计数细胞:取100μl台酚蓝于96孔板中,再加入25μl步骤六液,吹打混匀,取出10μl加在细胞计数板上,显微镜下计数活细胞。3.抗原AB刺激特异性T淋巴细胞使之产生特定的细胞因子一、根据标本数取本试剂盒中的微孔板,每份样本用4个检测孔,顺序标记各孔:○阴性对照、○抗原A、○抗原B、○阳性对照。(每条微孔板也标记好序号)。二、按顺序加入阴对(AIM-V)、抗原A、抗原B、阳对,各50

3、μl,每孔加100ul配置好的细胞液。(A和阴对用一个枪头,B和阳对用一个枪头),全部加完后,标注时间,放入CO2培养箱培养16-20小时。4酶联免疫检测☆☆☆三、次日准备1×PBS液,用200μlPBS洗板,重复洗4次.(洗去除因子外多余细胞及因子)四、根据标本量先计算好酶结合物工作液所需的量,以1:200的比例将酶结合物(酶标抗体)原液与PBS液混合,制成酶结合物工作液,每孔加50μl。4-8度孵育1小时。一、每孔用PBS液洗涤4次,然后加显色液50μl,暗处静置7min,加蒸馏水终止反应。13.显微

4、镜或放大镜,或自动计数仪计数

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