DNA重组技术(内含参考文献).ppt

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1、重组DNA技术与应用实例生物工程092范秋苹090302219一、重组DNA技术(RecombinantDNATechnique)1、何为重组DNA技术(RecombinantDNATechnique)?2、重组DNA技术研究的的理论基础；3、重组DNA技术研究的方法步骤；4、基因操作涉及的基本工具。1、何为重组DNA技术(RecombinantDNATechnique)?即用人工手段对DNA进行改造和重新组合的技术。包括对DNA分子的精细切割、部分序列的去除、新序列的加入和连接、DNA分子扩增、转入细胞的复制繁殖、筛选、克

2、隆、鉴定和序列测定等等，是基因工程技术的核心，为遗传育种和分子遗传学研究开辟了崭新的途径。2、重组DNA技术研究的的理论基础在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。3、重组DNA技术研究的方法步骤重组DNA技术一般包括四步：获得目的基因；与克隆载体连接，形成

3、新的重组DNA分子；用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；对转化子筛选和鉴定,在具体工作中选择哪条技术路线；对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。4、基因操作涉及的基本工具目的基因限制性核酸内切酶DNA连接酶基因克隆的载体受体细胞二、重组DNA技术应用实例本篇按受体细胞不同来分类；受体细胞为原核生物（举例说明）例1：重组人转化生长因子β̩在大肠杆菌中的表达及其活性检测例2：纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达*受体细胞为真核生物（举例说明）例1：人类胰岛素基因的

4、克隆及其真核表达载体的构建例2：纳豆激酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达受体细胞为原核生物（例1）重组人转化生长因子β̩在大肠杆菌中的表达及其活性检测摘自：现代康复2001年1月第5卷第1期ModernRehabilitation,January2001,Vol.5,No.1Abstract:ObjectiveWiththemethodofgenerecombinationtoexpresetheTGF-β̩inescharichiacoilandtodeterminitsnaturalactivity.MethodsThepl

5、asmidpTGF-β̩wasconstructedbyrecoveringTGF-β̩cDNAfragmentfrompBSK-TGF-β̩withEcoR1andPst1Digestion,andinsertingitdirectlyintoPBV220prkaryoticexpressioncector,atthesamesites.TherecombinantplasmidwastransformedinoEcoliDH5αandJM109toestablishtheprkaryoticexpressionsyste

6、mandinducedat42℃toexpressencodedprotein.ResultsSDS-PAGE,western-blotconfirmedthatthesystemcanexpressefficientlyTGF-β̩protein,whichwas23percentofthetotalbacterialsolubleprotein.TGF-β̩naturalactivityhasbeendeterminedbyNRKcell.ConclusionTheestablishmentofthissystempro

7、vidinganefficientexpressioncelllineforproductingTGF-β̩protrinonalargescale.摘要：目的运用基因重组的方法，对人转化生长因子β̩(TGF-β̩)进行基因克隆，并在大肠杆菌中表达。同时检测其生物活性。方法以pBV220作为原核细胞表达载体，用限制性内切酶将pBSksTGF-β̩中的TGF-β̩cDNA片段定向重组到pBV220的多克隆位点上，经酶切分析，筛选构建了原核细胞表达性质粒pTGF-β̩。将该质粒分别转化至大肠杆菌中，建立TGF-β̩原核表达体系p

8、TGF-β̩-DH5α和pTGF-β̩-JM109进行温度诱导表达。结果表达产物经SDS-PAGE分析,Western-blot,SDS、PAGE光密度扫描检测证实，该体系可高效表达TGF-β̩其表达产物约占菌体可溶性蛋白的23%。用NRK细胞对表达产物进行活性检测证明，本研究生产的TGF