八肝糖原的提取、鉴定与定量.ppt

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1、肝糖原的提取、鉴定与定量实验目的1.掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。2.了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。3.正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。4.熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。5.正确掌握溶液转移的操作。6.正确操作使用分光光度计。实验原理（一）肝糖原的提取、鉴定糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使用糖原与

2、蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95％乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。实验原理（二）肝糖原的鉴定糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。CuSO4+2NaOH═Na2SO4+Cu(OH)2↓2Cu(OH)2+C6H12O6═2CuOH+氧化型葡萄糖+H2O2CuOH═Cu2O↓(红色)+H2OCu(OH)2═CuO↓(黑色)+H2O△（三

3、）肝糖原的定量糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物—5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在(10~100)mg范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法（直接比较法）即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留肝糖原。实验原理实验材料（一）仪器1.普通离心机，室温~100℃恒温水浴箱（

4、×2），722型分光光度计，精度为10mg级电子天平（×1）2.剪刀（×1），镊子（×1），研钵（×1）3.试管架（×1），10mL离心管（×2），（100×15）mm试管（×6）4.刻度吸量管（2mL×1，5mL×2），1000μL微量可调取液器（×1）5.100mL容量瓶（×1）6.白瓷反应板（×1）实验材料（二）试剂1.鸡肝。2.95％乙醇。3.0.31mol/L(5％)三氯醋酸溶液：称取未潮解的三氯醋酸（C2HCl3O2，163.39）5g，加蒸馏水溶解至100mL。4.0.15mol/LNaCl溶液：称取

5、8.8gNaCl加蒸馏水溶解至1000mL。5.12mol/LHCl：浓HCl原液（36%~38%）。6.12.5mol/L(50％)NaOH：称取NaOH50g，用蒸馏水溶解至100mL。7.碘试剂：碘l00mg和K1200mg溶于50mL蒸馏水中。实验材料8.班氏试剂：称取柠檬酸钠（C5H5Na3O7·5H2O，294.10）17.3g和无水碳酸钠（Na2C03，105.99）100g溶于蒸馏水700mL中，加热促溶。冷却，慢慢倾人17.3％硫酸铜（CuSO4·5H2O，249.68）l00mL，边加边摇。再加

6、蒸馏水至1000mL，混匀，如混浊可过滤取滤液。此试剂可长期保存。9.5.35mol/L(30％)KOH溶液：称取KOH30g，加蒸馏水溶解至100mL。11.标准葡萄糖液(50mg/L)：称取已干燥恒重的无水葡萄糖25mg，加蒸馏水溶解至500mL。12.17mol/L(90％)H2SO4：量取蒸馏水30mL，加浓H2SO4500mL。13.蒽酮显色剂：称取蒽酮0.20g，用17mol/LH2SO4溶解至100mL。此试剂不稳定，以当日配制为宜，冰箱保存可用4~5天。操作步骤（一）肝糖原的提取操作步骤注意事项1肝

7、糖原提取一步，向上清液中加人等量的95％乙醇后，务必注意混匀。由于上清液为水溶液，比重大于95％乙醇，溶液分成两层。加之上清液已4mL多，加上等量乙醇，总量接近9mL，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。2糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在20个以下的会使碘呈现红色，2030个之间使碘呈现紫色，60个以上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分枝链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下（通常812个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。3糖原水解液中葡萄糖的

8、鉴定一步，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。操作步骤（二）肝糖原定量测定操作步骤操作步骤