生物化学与分子生物学实验课讲义.doc

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1、实验一SDS碱裂解法小量制备质粒一、实验目的1.掌握SDS碱裂解法小量制备质粒的原理和方法。2.掌握高速离心机、微量移液器等常规仪器的正确使用。二、实验原理对培养的含有大量质粒的菌液,离心收集菌体,用含一定浓度葡萄糖的缓冲液悬浮菌体,采用碱性SDS裂解细菌的细胞壁,使质粒缓和释放出来。同时整个溶液的pH为12-12.5,使断裂成线性细菌染色体DNA变成单链、相互交联缠绕附着在细胞壁碎片上,当液体的pH调至中性并有高浓度存在下,大部分蛋白质和细菌染色体形成沉淀,而共价闭环质粒DNA仍为可溶状态,离心获得含有大量质粒上清液

2、,用RNA酶A处理除去RNA,用苯酚氯仿除去残留蛋白质,再利用核酸不溶于有机溶剂的性质,从而使其在适当浓度的亲水性有机溶剂中(乙醇、异丙醇、PEG8000)沉淀析出。三、材料、试剂和仪器1.试剂GT116(含psiRNA质粒)菌种LB液体培养基溶液I、溶液II、溶液III、无水乙醇、氯仿、异戊醇、Tris饱和酚、RNA酶A、TE、STE、卡那霉素(配方见附录)2.仪器和材料超净台、高速离心机、微量移液器、灭菌eppendorf管和tips、37℃摇床、旋涡混匀器四、实验操作步骤1.在超净台内从平板上挑取单菌落或用以其它

3、方式保存的菌种接种于3mlLB培养基,在37℃培养15-18个小时。2.向1个2ml的离心管里加约1.5ml的菌液。不要把菌液溅出造成污染。3.10000rpm离心2分钟。注意离心机上放置的管重力要平衡,保护离心机。4.弃上清液于废液瓶中。5.重复离心一次,尽量弃去上清。6.加入100ul冰冷的溶液I,然后剧烈振荡混匀,置冰上。7.加入200ul溶液II,轻柔混匀,置冰上4分钟。8.加入150ul冰冷的溶液III,轻柔混匀,置冰上5分钟。9.12000rpm离心5分钟。把上清液转移到另一1.5ml离心管中(约450ul

4、)。10.加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混合液,剧烈振荡,12000rpm离心2分钟,小心的收取上层溶液(约450ul)于另一1.5ml离心管中。1.加入等体积氯仿:异戊醇,剧烈振荡,12000rpm离心2分钟,小心的收取上层溶液(约400ul)于另一1.5ml离心管中。2.2倍体积(800ul)-20℃预冷的无水乙醇,置冰上10分钟,沉淀质粒DNA。3.12000rpm离心5分钟,弃上清4.用1ml冰预冷的70%的乙醇洗沉淀,轻轻转动离心管,5.12000rpm离心1分钟,弃上清液。6.室温干燥沉淀。

5、加入50ulTE(含20ug/mlRNA酶A)溶解质粒,-20℃保存。五、质粒相关知识质粒是细胞染色外一种双链环状DNA分子,它随寄主细胞稳定遗传。对于质粒的研究始于1946年,美国科学家Lederberg.J.首先研究了细菌的性因子(F因子),随后科学家们又相继发现了细菌的抗药性因子(R因子),大肠杆菌素因子(CoE)等,并对这些染色体外遗传单位的性质、功能及与宿主的关系进行了的深入的研究,为建立第一批重组DNA载体提供了科学的材料。质粒DNA在细菌中的复制分为严紧型(stringentcontrol)和松弛型(re

6、laxedcontrol)。严紧型质粒的复制要在蛋白合成时和DNA聚合酶的III存在,只随染色体的复制而复制,其拷贝数少,每个细胞中只有1-10个;松弛型质粒的复制需要使用的是DNA聚合酶Ⅰ,它在细胞生长周期中随时可以复制,每个细胞中有10-200以上个拷贝。为了便于基因克隆,作为载体的质粒特点如下:1.是一个复制子,能自我复制。使它携带的目的基因得到大量扩增。2.分子量小(相对分子质量一般在106-107),拷贝数要高,便于应用(如便于提取、基因克隆、酶切鉴定、细胞转化、原位杂交等)。3.至少要有两个便于选择的遗传标

7、记,其一用于检查外源DNA是否插入到质粒中,例如载体中引入的LacZ基因,它编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个146个氨基酸的α-肽,可以被IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导合成,新合成的肽能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补,产生有活性的β-半乳糖苷酶,该酶能够水解X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷),生成蓝色的溴氯吲哚,使含X-gal的培养基中生长的菌落为蓝色。若有外源DNA插入LacZ中,因不能合成正确的α-肽,转化或转染的Lac缺陷菌株,用X-gal筛选,含阳性无隆载

8、体的菌落为白色,含空载体的菌落为蓝色;其二用于选择已把载体转化到细菌中的菌落,如氨苄青霉素抗性基因(Ampr),只有已转化含有质粒的重组菌在Amp培养基中才能生长。4.有多个单一的酶切位点,起点在某个遗传标记上,便于基因克隆,鉴定。提取的质粒多数以超螺旋型存在,超螺旋的DNA中一个螺旋由10个碱基形成,若一个螺旋大于或小于19个碱

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