叶绿体的分离和观察.doc

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1、生命科学学院LifeScienceCollege细胞生物学实验报告姓名：柳伟雄班级：2013级生科一班学号：201300140062同组者：曾玮璠山东大学实验报告2015年5月10日姓名：柳伟雄系年级：生科一班2013级同组者：曾玮璠科目：细胞生物学实验题目：叶绿体的分离和观察一、目的和要求1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法二、原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降

2、速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。一次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。叶绿体的分离应在等身溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体损伤。将匀浆液在1000r/min的条件下离心2分钟，以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5分钟

3、，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在0℃—5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和无荧光油。三、试剂和器材1.材料：新鲜菠菜2.试剂：（1）0.35mol/L氯化钠溶液（2）0.01%吖啶橙（acridine orange）3、器材：（1）主要设备：普通离心机，组织捣碎机，粗天平，荧光显微镜（

4、2）小型器材：500ml烧杯2个，250ml量筒1个，滴管20支，10ml刻度离心管20支，试管架5个，纱布若干，无荧光载玻片和盖玻片各4片等四、实验步骤1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml0.35mol/LNaCl溶液中，装入组织捣碎机2.利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆2—3分钟3.将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中4.取滤液4ml在1000r/min下离心2min，弃去沉淀5.将上清液在3000r/min下离心5分钟。弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细

5、胞核）6.将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮7.取上述叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察：①在普通光镜下观察；②在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光；③在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光，取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载玻片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料，加盖玻片后即可在荧光显微镜下观察。五、实验结果染色未染色1.在普通光镜下，叶绿体呈现绿色的长椭圆形2.在荧光显微镜下，当用绿光照射时，叶绿体发出红色荧光；而用蓝光照射时，同样发出红色荧光，相对绿光照射时的较暗。

6、而用吖啶橙染色后，叶绿体发出红色荧光，而混杂在其中的细胞核细胞核发出绿色荧光