细胞培养标准操作程序(SOP).doc

细胞培养标准操作程序(SOP).doc

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1、细胞培养标准操作程序(SOP)1.目的:为了保证培养细胞的正常生长,实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤,特制订实验室细胞培养操作流程。2.适用范围:适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。3.操作规程:3.1  培养液、PBS、胰蛋白酶的配制3.1.1 1000ml培养液的配制1、准备用品:培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2~3天内的新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶(100ml×10个玻璃瓶)、青霉素、链霉素、2~3个过滤器、注射器。紫外线照台

2、30min。2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)溶解,并冲洗袋内残留粉末。3、充分搅拌,按说明添加成分(如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g,Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉3.7g等),再充分搅拌。无需加谷氨酰胺,因该培养基里已含有。4、用1M(1mol/L)HCl 调PH至7.0左右(细胞适宜在PH7.2~7.4生长,配制好后PH值会升高0.2~0.3,故配时调PH至7.0左右)。5、用新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)定容到1000ml。6

3、、配青霉素 80万/瓶 +4ml 蒸馏水       溶解 配链霉素100万/瓶 +4ml 蒸馏水      溶解  取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培养液中,使其终浓度均为100U/ml,充分搅拌混匀。7、在无菌操作台里用0.22um的除菌滤膜过滤配制好的培养液,并分装到到100ml玻璃瓶中,玻璃瓶口用薄膜封口,盖上橡皮塞,放-20℃保存备用。注意:(1)配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和(或)NaOH均需新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)配制。    一般于配制当天制备,以保证水的纯度和质量。(2

4、)准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌!烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水(或新鲜反渗    水)的容器均不需高压灭菌,干净即可。 3.1.2  PBS(平衡盐溶液)的配制 NaCl 8g KCl 0.2g              +新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)至1000ml Na2HPO4*H2O 1.56g KH2PO4 0.2g (1) 无需调PH值,其成分溶解后PH为7.4,不需除菌滤膜过滤除菌,放于4℃保存,用前直接高压灭菌(高压时,装PBS的瓶子的瓶盖要插针头!)  (2) Na2HPO4*H2O 1.56

5、g 则Na2HPO4*12H2O需3.4888g (3) 如欲配制500ml,以上成分减半即可 3.1.3  0.25%胰蛋白酶的配制   胰蛋白酶粉          2.5g  EDTA(乙二胺四乙酸二钠) 0.3g  NaCl                    8.0g          KCl                       0.4g                            `     +新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)至1000ML  NaHCO3           0.5g  Gluco

6、se(葡萄糖) 1.0g   酚红                     0.06g(1)配出来的PH值为7.6,在PH值7.6~7.8范围内,故不需调PH值。(2)用0.22um的除菌滤膜过滤分装,瓶口用薄膜封口,放-20℃保存备用。4℃可连续使用1月左右。(3)用于分装的玻璃瓶必须事先高压灭菌!而烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)的容器均不需高压灭菌,干净即可。(4)如欲配制500ml,以上成分减半即可 3.2  细胞复苏1、准备:紫外线照台30min,准备好装有高压灭菌好的吸管、试管的饭盒、废液缸;培养基

7、临用前放水浴箱里温育20分钟。在操作台上摆放好物品,左边为饭盒、培养液等,中间为酒精灯、试管架等,右边放滴管架、镊子,右上角放废液缸。2、灼烧培养瓶口及瓶盖,用滴管取培养基5ml加入试管中(一滴约为50ul)。3、戴手套,从-196℃液氮罐中取出冻存管,立即放入37℃水浴箱中快速解冻,同时不断轻轻摇动冻存管,保证冻存管内细胞1min内融化。以70%酒精擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。(慢冻快融)4、用吸细胞液的滴管从冻存管中完全吸出细胞悬液,加入到已装有培养基的试管中,塞子塞试管,800rpm离心2min(用培养基且离心的

8、目的:去除细胞冷冻保护剂DMSO,因常温下其对细胞毒性大),弃上清,试管底部的白色物质为细胞,轻弹混匀。往试管中加培养基、FBS(胎牛血清)各80滴和20滴(使FBS浓度为20%)。用吸细胞液的滴管轻轻吹打,使细胞混匀,以免在培养瓶里成团,影响细胞生长。5、将试管中的细胞悬液用吸细胞液的滴

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