过氧化氢酶活性测定.doc

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1、过氧化氢酶活性测定过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中,其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系,故常加以测定。紫外吸收法一、原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。【仪器与设备与试剂】1、材料小麦叶片等。2、仪器设备研钵;离心机;250ml容量瓶;移液管(0.5ml、2ml各2支);10ml试管3支;恒温水浴;紫外分光光度计;3、试剂0.2mol/LpH7.8磷

2、酸缓冲液(内含1%聚乙烯吡咯烷酮);0.1mol/LH2O2(用0.1mol/L高锰酸钾标定)。【方法】1.酶液提取:称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中,加入2~3ml4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后,转入25ml容量瓶中,并用缓冲液冲洗研钵数次,合并冲洗液,并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min,取上部澄清液在4000rpm下离心15min,上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。2.酶活性测定取10ml试管3支,其中2支为样品测定管,1

3、支为空白管,按表2-14-1顺序加入试剂。表2-14-1紫外吸收法测定H2O2样品液配置表管号S1S2S3管号S0S1S2粗酶液(ml)0.20.20.2蒸馏水/ml1.01.01.0pH7.8磷酸(ml)1.51.51.5将S0号管在沸水浴煮1min以杀死酶液,冷却。然后将所有试管在25℃预热后,逐管加入0.3ml0.1mol/L的H2O2,每加完一管立即记时,并迅速倒入石英比色皿中,240nm下测定吸光度,每隔1min读数1次,共测4min,待3支管全部测定完后,按下式计算酶活性。3.结果计

4、算:以每分钟A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(U)。过氧化氢酶活性U/(g.min)=A240=AS0-式中AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值;AS1,AS2—样品管吸光值;Vt—粗酶提取液总体积(ml);V1—测定用粗酶液体积(ml);FW—样品鲜重(g);0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位(u);t—加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。【注】所用H2O2溶液及KMnO4一溶液临用前需重新标定。【注意事项】凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。   高锰酸钾滴定法 一

5、、原理    过氧化氢酶(catalase)属于血红蛋白酶,含有铁,它能催化过氧化氢分解为水和分子氧,的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量(反应过量)的过氧化氢溶液,经酶促反应后,用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H2O2的量。    二、材料、仪器设备及试剂    (一)材料小麦叶片    (二)仪器设备1.研钵;2.三角瓶;3.酸式滴定管;4.恒温水浴;5.容量瓶。    (三)试剂:1.10%H2SO4。2.0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液

6、。3.0.1mol/L高锰酸钾标准液取KMnO4(AR)3.1605g,用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml,再用0.1mol/L草酸溶液标定。4.取30%H2O2溶液5.68ml,稀释至1000ml,用标准0.1mol/LKMnO4溶液(在酸性条件下)进行标定。5.0.1mol/L草酸:称取优级纯H2C2O4.2H2O12.607g,用蒸馏水溶解后,定容至1000ml。    三、实验步骤    (一)酶液提取取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量,研磨成匀浆,转移至25ml容量瓶

7、中,用该缓冲液冲洗研钵,并将冲洗液转至容量瓶中,用同一缓冲液定容,4000rpm离心15min,上清液即为过氧化氢酶的粗提液。    (二)取50ml三角瓶4个(两个测定,另两个为对照),测定瓶加入酶液2.5ml,对照加煮死酶液2.5ml,再加入2.5ml0.1mol/LH2O2,同时计时,于30℃恒温水浴中保温10min,立即加入10%H2SO42.5ml。    (三)、用0.1mol/LKMnO4标准溶液滴定,至出现粉红色(在30min内不消失)为终点。    四、结果计算    酶活性用

8、每g鲜重样品1min内分解H2O2的mg数表示:    过氧化氢酶活性(mg/(g.min)=(A-B)×    式中:A对照KMnO4滴定ml数;B酶反应后KMnO4滴定ml数;VT提取酶液总量(ml);VS反应时所用酶液量(ml);W样品鲜重(g);t反应时间(min);    1.7ml为0.1mol/LKMnO41ml相当于1.7mgH2O2。     母亲的眼神是那么的慈爱,自打儿女呱呱坠地起,那一抹温柔的眼眸,就有如一道无形的细线,系在儿女的身上,儿女走到哪里,母亲的牵挂就延伸到哪里

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