实验4、DNA和RNA的浓度检测.doc

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1、实验四、DNA和RNA的的浓度检测【实验目的】熟练掌握分光光度法检测DNA纯度和浓度的方法。【实验原理】DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。对标准样品来说，浓度为1μg/ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02，当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg/ml；ssDNA浓度约为37μg/ml；RNA浓度约为40μg/ml；寡核苷酸浓度约为30μg/ml（youyu底物不同有差异）当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时

2、，会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。经验值：纯DNA：OD260/OD2800≈1.8(＞1.9,，表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）。OD260/OD280的比值用于估计核酸的纯度,OD260/OD230估计去盐的程度。对于RNA纯制品，其OD260/OD280≈2.0，OD260/OD230应大于2。OD260/OD280<2.0可能是蛋

3、白污染所致,可以增加酚抽提;OD260/OD230<2说明去盐不充分，可以再次沉淀和70%乙醇洗涤。【实验材料】DNA和RNA【试剂和器材】试剂：灭菌重蒸水；TE缓冲液。器材：移液器；石英比色皿；紫外分光光度计等。【实验步骤】1、紫外分光光度计开机预热10min。2、用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后，放入样品室的S池架上，关上盖板。3、设定狭缝后校零。4、将标准样品和待测样品适当稀释（DNA5μl或RNA4μl用TE缓冲液稀释至1000μl）后，记录编号和稀释度。5、把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板。6、设定紫外光波

4、长，分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值。7、计算待测样品的浓度与纯度。DNA样品的浓度（μg/μl）:OD260×稀释倍数×50/1000RNA样品的浓度（μg/μl）：OD260×稀释倍数×40/1000【实验结果】