用分光光度计测DNA、RNA的浓度.doc

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1、用分光光度计测定质粒DNA的浓度一、目的熟练掌握分光光度法检测DNA纯度和浓度的方法。二、原理DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。对标准样品来说，浓度为1μg/ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg/mlssDNA浓度约为37μg/mlRNA浓度约为40μg/ml寡核苷酸浓度约为30μg/ml（youyu底物不同有差异）当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他

2、小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。经验值：纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1。6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用方案二的方法或其他方法进行估算。三、材料、试剂及器具1、材料提取的PUC19样品、PUC19标准样

3、品2、试剂灭菌重蒸水，TE缓冲液四、操作步骤1、UV-240紫外分光光度计开机预热10min.2、用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后，放入样品室的S池架上，关上盖板。3、设定狭缝后校零。4、将标准样品和待测样品适当稀释（DNA5μl或RNA4μl用TE缓冲液稀释至1000μl）后，记   录编号和稀释度。5、把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板。6、设定紫外光波长，分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值。7、计算待测样品的浓度与纯度。DNA样品的浓度（μg/μl）:OD26

4、0×稀释倍数×50/1000RNA样品的浓度（μg/μl）：OD260×稀释倍数×40/1000 PS：对于一般的紫外分光光度计，若用1cm的石英比色皿，则至少稀释到3ml，才能达到光照高度的量。根据上述材料的描述，1、取DNA5μl，用水或TE（DNA用什么溶的就选择什么稀释）稀释至3Ml.稀释倍数则为600.2、分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值3、（1）计算DNA纯度：OD260/OD280纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1。6，表明有蛋白质、酚等污染）（2）计

5、算DNA浓度（μg/μl）:OD260×稀释倍数×50/1000