组织DNA与RNA的分离和提取.doc

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1、组织DNA与RNA的分离和提取一、实验材料1.器材手术器械、匀浆器、台式微量高速离心机、微量加样器、振荡器、水浴锅。2.试剂（1）0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA：称NaCl8.18g、乙二胺四乙酸二钠盐3.72g，加蒸馏水溶解，调pH至7，稀释至1000ml，贮放冰箱中；（2）25%SDS：称取十二烷基硫酸钠25g，溶于50%的乙醇中至100ml，室温存放；（3）2mol/LNaCl：称11.7gNaCl，用蒸馏水配置成100ml溶液；（4）氯仿-异戊醇：氯仿24份与异丙醇1份混匀；（5）80%酚：取苯酚80份，加蒸馏水20份，混匀后装

2、棕色瓶中；（6）0.05mol/L醋酸缓冲溶液（pH5.0）：0.5mol/L醋酸钠35ml，0.2mol/L醋酸15ml，加蒸馏水稀释至1000ml，混匀后测pH应为5.0；(7)2mol/L醋酸钠：取无水醋酸钠16.4g，用蒸馏水溶解后配成100ml；（8）95%乙醇。二、实验操作1.组织DNA的分离提取（1）小鼠剪短颈动脉，放血处死，开腹取其脾及两肾（约0.3g），浸入预冷至0℃的0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA中，洗去血液，剥去周围的脂肪及结缔组织，用滤纸吸干。（2）将组织剪碎，转入玻璃匀浆器中，加入0.14mol/LNaCl-0

3、.01mol/LEDTA液7ml，旋转上下匀浆，至绝大部分细胞破碎为止。（3）2500r/min离心15min，吸去上层液体，向沉淀中再加入0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA混匀，离心洗涤之（如欲获得RNA含量极少的纯DNA时，此步离心洗涤应重复多次）。（4）经洗涤后的沉淀，加入3ml0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA，在搅拌下缓缓滴入25%SDS0.4ml，转入匀浆器内混匀，使沉淀悬浮均匀，再加入2mol/L的NaCl4ml。此时，由于大部分脱氧核苷酸蛋白溶出，溶液粘度骤然升高，再匀浆一次使之均匀。（5）转入三角瓶中，

4、加等溶剂的氯仿-异戊醇约8ml，剧烈振摇10min，3000g离心10min，上层为水液，下层为氯仿，中间界面为变性蛋白质，吸出上清水液（如欲获得掺杂蛋白质较少的DNA，抽提和离心可重复多次，直至界面看不到变性蛋白质层为止）。（6）上层水液边摇边加入等体积的95%乙醇，即可见有长纤维线状DNA析出，用玻棒搅拌，DNA及粘缠在玻棒上，瓶壁上尽量将水分挤干。（7）缠在玻棒上的DNA纤维溶于1ml0.1mol/L溶液中，待定量和电泳分析。2.组织RNA的分离提取（1）饥饿一天的小鼠，放血处死，解剖出肝，浸于预冷至0℃的0.05mol/L的醋酸缓冲液（pH5.0）中，

5、剥去肝门处的结缔组织，洗去血液，用滤纸吸干。（2）取0.3g肝，加入0.05mol/L醋酸缓冲液（pH5.0）3ml、25%SDS0.5ml，移入匀浆管，匀浆后加入等体积80%酚，再匀浆一次。（3）移入三角瓶中，置65℃水浴中继续振摇5~8min，取出后冷却。（4）3000r/min离心10~15min，上层水相含有RNA稍浑浊，中层为变性蛋白质，下层为酚液，管底残喳中含有DNA。吸出上层水液（若要提高RNA的收获量，可向中下层液中再加入1/2体积的醋酸缓冲液，重复65℃水浴振摇、离心步骤，合并两次的上层水液）。（5）分别加入1/10体积的2mol/L醋酸钠、

6、2.5倍体积遇冷的95%乙醇，混匀，于冷处放置至絮状沉淀充分形成。（6）3000r/min离心10min，弃上清，离心管倒置于滤纸片上，尽量使液体流干。（7）RNA沉淀用蒸馏水1ml溶解，待定量和电泳分析。三、注意事项1.DNA和RNA的提取操作应在4℃进行。2.手上有RNA酶，提取RNA时应戴手套，尽量避免RNA酶污染。3.提取DNA时，需待纤维状DNA大分子充分析出后，再用玻璃棒将其缠绕出来。Trizol法是利用RNA和DNA在溶液中分布不同将其分开，RNA分布在水相中，DNA分布在有机相中，用乙醇将DNA沉淀下来。其它的DNA提取方法：酚抽提法、甲酰胺解

7、聚法、TRIzol法详见《组织与细胞培养技术》第267页