DB32∕T 1770-2011 A 群猪轮状病毒的检测RT-PCR 方法.pdf

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1、ICS65.020.30B41备案号：DBDBDBDB32323232江苏省地方标准DB32/T1770—2011A群猪轮状病毒的检测RT-PCR方法MethodofRT-PCRfordetectingPorcineRotavirusgroupA2011-05-06发布2011-07-06实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T1770—2011前言为规范A群猪轮状病毒分子生物学检测技术，提高A群猪轮状病毒检测的灵敏度、稳定性、特异性，特制定本标准。本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》

2、编写。本标准的附录A为规范性附录。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：倪艳秀、何孔旺、郭容利、温立斌、吕立新、张雪寒、周俊明、李成仁、俞正玉、茅爱华、李彬、王小敏。IDB32/T1770—2011A群猪轮状病毒的检测RT-PCR方法1范围本标准规定了A群猪轮状病毒的检测RT-PCR方法的所用仪器设备和主要试剂、引物、方法步骤、结果判定、废弃物处理和防止污染的措施等技术标准。本标准适用于A群猪轮状病毒的RT-PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的

3、引物文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB16548-2006病害动物和病害动物产品生物安全处理规程GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法NY/T541-2002动物疫病实验室检验采样方法3原理RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。本标准根据GenBank上公布的A群猪轮状病毒（PRV）衣壳蛋白VP7基因序列，在其

4、保守区设计一对特异性引物，先提取待检样品的RNA，用下游引物进行RT，再以cDNA为模板进行PCR。4仪器设备和主要试剂4.1仪器设备4.1.1高速离心机4.1.2PCR仪4.1.3核酸电泳仪4.1.4凝胶成像系统4.2主要试剂除另有规定，所用试剂均为分析纯。4.2.1焦碳酸二乙酯(DEPC)水4.2.2TRIzol4.2.3RNA酶抑制剂4.2.4AMV反转录酶4.2.5Taq酶4.2.6dNTP4.2.7琼脂糖，电泳级1DB32/T1770—20115引物上游引物：5′-GTATGGTATTGAATATACCAC-3′；

5、下游引物：5′-GATCCTGTTGGCCATCC-3′。6方法步骤试验用水：按照GB/T6682-2008三级水标准。6.1样品处理6.1.1粪便样品的处理按照NY/T541-2002，采集腹泻猪的粪便，在粪便中按1：10加入DEPC水，剧烈震荡使其混和均匀，5000r/min，离心20min，取上清于-20℃备用。反复冻融三次后，以5000r/min，离心20min，取上清。阴性粪便对照：正常猪粪便。阳性粪便对照：感染A群猪轮状病毒的猪粪便。阴性、阳性粪便对照也同样处理，对每个样品进行编号标记。另外，按照GB16548-

6、2006处理待检粪便。6.1.2可疑细胞培养物样品的处理可疑细胞培养物反复冻融三次后，以5000r/min，离心20min，取上清。阴性细胞培养物对照：正常MA104细胞。阳性细胞培养物对照：A群猪轮状病毒细胞培养物。阴性、阳性细胞培养物对照也同样处理，对每个样品进行编号标记。6.2RNA的提取在200µL上清中加入TRIzol800µL，振荡混匀后，室温放置5min，加入氯仿200µL，剧烈振荡后，室温放置10min，4℃12000r/min，离心10min，取上清，加入0.5mL异丙醇，混匀，-20℃放置2h以上，4℃1

7、2000rpm离心15min，去上清，沉淀用1ml75%的无RNA酶的乙醇洗涤，4℃7500r/min离心5min，去上清，室温干燥RNA沉淀20min，加入DEPC水12µL，使充分溶解，-20℃冻存备用。6.3RT-PCR6.3.1反应条件反转录反应：按20µL体系进行，5×Buffer4.0µL、dNTP（10mM）2.0µL、下游引物（50pmol/µL）1.0µL、RNA酶抑制剂0.5µL、RNA模板12.0µL，AMV反转录酶0.5µL，瞬间离心混匀，65℃反应15min，42℃孵育1h，95℃5min，同时设立

8、阴性、阳性对照，产物于-20℃保存备用。PCR反应：按25µL体系进行，10×buffer2.5µL，MgCl2（25mM）1.0µL，dNTP（2.5mM）1.0µL，上游引物（50pmol/µL）0.5µL，下游引物（50pmol/µL）0.5µL，模板DNA3.0µL，Taq酶（5U