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1、上海医科大学学报1999Mar,26(2)JShanghaiMedUniv141用PCR方法检测B细胞淋巴瘤克隆性IgH基因重排田晓峰许良中朱伟萍张泰明李小妹金爱萍何开玲(上海医科大学肿瘤医院分子病理研究室上海200032)用PCR方法检测克隆性IgH基因重排正在成方案采用半巢式PCR,但有些地方作了必要的改为B细胞淋巴瘤基因诊断的有效手段。与Southern进。反应总体积为25μl,1×缓冲液,另含MgCl2分析法相比,前者有明显的优点:快速简便,标本用1.5mmol/L,dNTP200μmol/L,taqDNA聚合酶量少并可用于石蜡切片,无放射性危害等。PCR所1.
2、5u(Promega公司产品),引物各12.5pmol(即用引物是辨认IgH基因可变区(V)和连接区(J)中0.5μmol/L)。第一步反应冰冻组织样本加DNA存在的相对保守的结构区(frameworkregion,FR)。200ng,石蜡切片消化上清液加3～6μl;第二步反应这样的结构在V区有3个,分别称作FRⅠ、FRⅡ、加1∶50稀释的第一步反应产物1μl作模板。反应条FRⅢ,J区也有1个。国外曾有人对所设计出的几件第一步为:94℃预变性5min后,于94℃45s,55种引物的阳性检出率和灵敏度进行过对比研℃454s,72℃60s条件下循环35次,72℃延伸10[1
3、,2]min;第二步反应条件相似,但只25个循环。PCR究,但什么样的引物或引物组合最适合于国人尚不清楚。因此,我们用半巢式PCR方法分别研究仪为美国PE公司的GeneAmpPCRSystem9700。了冰冻和石蜡淋巴瘤标本的3种不同引物(FR3A、PCR产物分析取8μlPCR产物进行聚丙烯FR3、FR2)的扩增效果,并在方法上有所改进,提高酰胺凝胶(12%)电泳(PAGE),硝酸银染色后用凝了检出的灵敏度和阳性率。胶摄录分析仪观察记录结果。材料与方法结果病理标本所有标本的病理诊断由本院病理科灵敏度检查将从Raji细胞提取的DNA用从根据形态观察并结合免疫组化作出。其中
4、冰冻标本反应性增生淋巴结提取的DNA作梯度稀释,按冰36例,包括B细胞淋巴瘤(B-NHL)28例,T细胞淋冻组织条件作PCR,结果一步反应的灵敏度FR3A巴瘤(T-NHL)2例,霍奇金病(HD)和反应性增生和FR3可达0.1%,FR2为1%(图1);两步反应3(RH)各3例;石蜡标本17例,包括B-NHL15例,种引物的灵敏度均可达0.1%,说明该方法有满意T-NHL2例。每批实验均用B淋巴瘤细胞珠Raji和的敏感性。BJAB的DNA作阳性对照。标本处理冰冻标本从液氮中取出后经粉碎,按常规方法提取DNA,并作浓度和纯度测试。石蜡切片为B5固定液固定。先按常规方法脱蜡,再
5、经脱汞脱碘处理:切片依次置1%碘酒溶液30min,1.2%硫代硫酸钠10min(至无色),0.5%硫代硫酸钠(含千分之0.04浓盐酸)5min,双蒸水漂洗3次,37℃烘干。刮取切片厚度为10μm,总面积为0.52～1cm的组织于加有50～100μl消化液的Eppen-图1RajiDNA梯度稀释后的第一轮扩增结果dorf管中,消化并离心取上清液待用[3]。模板质量Fig1ResultsofthefirststepamplificationofRajiDNAseriallydilutedwithDNAfromRHtissue用β-globin基因引物(上游:173～193,
6、下游:315～Thenumbersontopofthelanesarethepercentagesof335)作PCR检查。RajiDNAintotalDNA.M:pBR322DNA/HaeⅢMarkers[4]PCR条件引物参考有关文献由中科院上冰冻组织标本在28例B-NHL中FR3A、FR3[1]海细胞生物学研究所合成。实验按Achille等的142上海医科大学学报1999年3月,26(2)和FR2的阳性数分别为24(86%)、23(82%)和18讨论(64%)。FR2阳性率较低,但与前两者的互补性克隆性IgH基因重排对B淋巴细胞增生性疾强,4例FR3A的阴性标本中
7、有两例FR2结果阳病的诊断有重要意义。PCR方法的出现为其临床性。总阳性率为93%。B-NHL阳性结果呈现清晰应用的普及提供了良好的条件。但是,这种方法的的1条或2条(双等位基因重排)带,片段大小稳定性、灵敏度和简便性上仍未达到理想的程度。FR3A和FR3为80～130bp,FR2为230～280bp。我们采用3种不同的V区引物FR3A、FR3、FR2和共计8例RH、HD和T-NHL中,除1例HD(1/3)阳共同的J区引物LJH和VLJH对相同的冰冻和石性外,其余均为阴性结果,呈弥漫状或多克隆条带。蜡切片标本作平行的半巢式PCR扩增,并用
