生物实验4 实时定量PCR 实验报告.doc

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1、实验四定量PCR扩增姓名：李宗翰专业：环境工程学号：1432999同组人姓名：刘雪飞一、实验目的复习定量PCR原理，熟悉绝对定量的操作流程二、实验原理实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析三、实验仪器及材料realtimePCR仪(ABI7500,RotorGene3000)，微量移液器，Tip头，0.2ml光学薄壁管，8联PCR管，1.5ml离心管，SYBRMix，引物及1

2、08copy/ul标准品四、实验步骤1、标准样品稀释：取4个1.5ml的离心管，写上标记107，106,105,104，向每管加入90μlddH2O，取10μl108copy/ul的标样加入到107管中，充分混匀后，从管中取10μl107copy/ul的液体到106管中。按上述操作依次稀释，得到5个倍数的标准样品。注意，每次稀释都要换Tip头。2、配制预混液：取119μlddH2O、7μl引物4204f、7μl引物4448r和7μlRox到装有175μlSYBRMix液的1.5ml离心管中，混匀。3、分装预混液：取7个小离心管，分别标记108、107、106、105、104、UNK（未知

3、样）、NTC（阴性对照）。向其中分别加入42μl预混液和4.7μl模板（1-5号加标样、6号加未知样、7号加等量ddH2O），混匀。4、戴上手套取两个8联管，并排放置管架上。分别取上述样品20μl至第1-7管中（第8管空出），每个样品两个重复，共14个样品。将加好样的8联管振荡。5、设置分析仪参数如下：95℃3min；95℃15s+60℃40s为一个循环，循环次数40，融解曲线温度范围60~95℃。振荡好的样品进机进行PCR扩增。6、扩增后利用软件分析CT值及未知样的定量结果。五、实验结果与讨论1、实验结果如何？试分析。答：实验结果及分析如下。（1）、实验具体数据见下表WellTaskC

4、тCтMeanCтSDQuantityQuantityMeanQuantitySDCtThresholdA1STANDARD8.24888.25270.00551000000000.0712A2STANDARD8.25658.25270.00551000000000.0712B1STANDARD11.389311.65980.3825100000000.0712B2STANDARD11.930311.65980.3825100000000.0712C1STANDARD15.329214.96680.512610000000.0712C2STANDARD14.604314.96680.51

5、2610000000.0712D1STANDARD19.491219.30800.25901000000.0712D2STANDARD19.124919.30800.25901000000.0712E1STANDARD22.538522.41960.1681100000.0712E2STANDARD22.300722.41960.1681100000.0712F1UNKNOWN8.93708.96910.045459501332583025841695285.6250.0712F2UNKNOWN9.00128.96910.045457103836583025841695285.6250.

6、0712G1NTC32.53290.0712G2NTC32.95490.0712其中，A-E为标准样品，F为位置样品，G为阴性对照。每个样品做两个平行。通过软件分析，由标准曲线得到的未知样品的定量结果约为5.83×107。（2）、扩增曲线从扩增曲线中可以看出，样品均经历了良好的扩增过程。（3）、标准曲线从标准曲线中可以看出，R2值较好，标准曲线可以使用。但扩增效率一般。其中106和107的两个平行样的CT偏差较大，这一现象可以从（1）表中看出，其SD分别为0.5126和0.3825，相比其他点较大，一般认为SD大于0.5不理想。（4）、融解曲线图中，可以看出每条曲线均为单峰且在一个合理的

7、温度范围内（82~86℃），所以扩增是正常的，不存在非特异性扩增。2、实验过程中需要注意些什么细节？答：（1）、操作过程中尽量不要说话，以避免污染；（2）、用微量移液器加样品时应保证枪头深入液面以下，这样样品不会留在管壁上；（3）、不能在定量PCR管做标记，裸手不可以接触定量PCR管，操作时应戴手套。（4）、8联定量PCR管加完样后，可先将盖子放上，等放到振荡机上再把盖子盖紧。3、通过这个实验你有什么收获？这个实验对你今后开展相关实