医学遗传实验讲义.doc

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1、医学遗传学实验讲义浙江大学医学院医学遗传学课程组2012年9月3日实验一人类外周血染色体标本制备一、实验目的通过实验了解和掌握人类外周血染色体标本培养和制备的基本方法。二、实验原理正常情况下，外周血中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，外周血细胞中是没有分裂相的。1960年，Nowell和Morhead证实，外周血中的小淋巴细胞可以在植物血凝素（phytohemagglutinin,PHA）或其它有丝分裂刺激剂的影响下，在形态上转变为淋巴母细胞，在培养中进行有丝分裂。这样经过短期培养（colchici

2、ne），秋水仙素的处理，低渗和固定，就可以迅速而又简便地获得体外生长的细胞群体和有丝分裂相。本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。三、实验准备实验材料人外周血（淋巴细胞）实验器具离心机、恒温培养箱、恒温水浴箱、培养瓶、刻度离心管、注射器和针头（61/2号）、吸管、量筒、火柴、酒精灯、pH计、研钵、饭盒、超净工作台、镊子、载玻片、玻片盒、烧杯、染缸、试管架、玻璃铅笔或记号笔、显微镜、擦镜纸、吸水纸等。药品和试剂1．培养液的配制RPMI1640培养基(含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠)80%小

3、牛血清(56℃水浴灭活30分钟，灭活可破坏补体及一些污染的病毒)20%植物血凝素PHA(主要成分是粘多糖和蛋白质,可用培养基溶解)4%青霉素终浓度　100U/ml链霉素终浓度　100U/ml用3.5%NaHCO3调pH7.0～7.2，用玻璃滤器，抽滤灭菌。在超净工作台，分装到培养瓶中（每瓶含培养基5ml）。培养液置于-20℃冰箱保存。使用前从冰箱中取出，温育至37℃。2．肝素浓度为0.2%，作为抗凝剂使用。200mg肝素粉末溶于100ml生理盐水中。高压灭菌，-4℃冰箱保存备用。3．KCl浓度为0.075

4、M，0.559g氯化钾溶于100ml双蒸水中。氯化钾作为低渗液的优点是染色体轮廓清楚，可染性增强，时间缩短。4．秋水仙素10mg/ml，作为有丝分裂的阻止剂，抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停止在中期。称取10mg秋水仙素溶于100ml生理盐水中，配成100mg/ml的原液，分装小瓶，高压灭菌，-20℃冰箱保存备用。临用时取上述原液用生理盐水稀释成10mg/ml。5．甲醇6．冰醋酸7．吉姆沙(Giemsa)染液吉姆沙原液：先将0.5g吉姆沙粉末干研磨，时间越长越好；加33ml60℃预热的纯甘油，在研钵

5、中研磨，放在60℃恒温水浴中保温90分钟。冷却后，再加入33ml甲醇，充分搅拌，用滤纸过滤，收集在棕色瓶中保存，作为原液。原液要提前半年配制。原液中按比例加入磷酸缓冲液即可染染色体标本。1份Giemsa原液＋9份磷酸缓冲液8．磷酸缓冲液(pH6.8)溶液A：磷酸二氢钾(KH2PO4.2H2O)9.078g溶于1000ml蒸馏水中。溶液B：磷酸氢二钠(Na2HPO4.2H2O)11.876g溶于1000ml蒸馏水中。100ml缓冲液：需溶液A50.8ml，溶液B49.2ml。四、实验步骤1．采血先在供血者肘

6、部用酒精棉球消毒，取2ml干燥灭菌注射器，配上针头（61/2号）并吸取肝素液0.2ml湿润针筒，采静脉血2ml，转动针筒使血与肝素混匀。2．培养采血完毕立即将针头插入含RPMI1640培养瓶内（瓶盖预先用酒精棉球消毒），每瓶滴入30滴血，摇匀。2ml血可分装三至四瓶。置37℃±0.5℃恒温中培养72小时，其间可摇动2~3次。3．秋水仙素(colchicine)处理在终止培养前2~3小时，加入秋水仙素，61/2号针头3滴（每ml约60滴），使细胞分裂终止在中期。秋水仙素的浓度不宜过高和作用时间过长，虽然这样

7、做可以得到较多的分裂相，但导致染色体过分缩短，不宜用于显带分析。4．离心将培养物倒入刻度离心管内，以1000rpm离心10分钟，弃去上清液，留底层沉淀物并用吸管打匀。5．低渗处理加8ml预温(37℃)的0.075MKCl低渗液，用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中，37℃水浴箱静止25~30分钟，使白细胞膨胀，染色体分散，红细胞解体。低渗处理的效果与低渗的成分、处理的时间和温度有关。这是比较关键的一步，对任一组织和低渗液都要事先进行预实验，以确定最合适的处理时间。6．预固定在低渗25~30分钟后，加新配置的固

8、定剂（甲醇:冰醋酸，3:1）1ml，打匀。这样有助于细胞的均匀悬浮而不团聚凝块和防止细胞丢失。甲醇和冰醋酸要现配现用，如放置时间较长，即不宜再用，以免影响固定效果。7．再离心1000rpm离心10分钟，弃去上清液，留沉淀物。8．固定沿离心管壁加入新配制的固定液（甲醇:冰醋酸，3:1）至5ml，将沉淀物打匀，固定15~25分钟。9．再离心1000rpm离心10分钟，弃去上清液。10．再固定：加入新配制的固定液（甲醇:冰醋酸，1