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2、到本机查看。第28卷,第2期 光谱学与光谱分析2008年2月 SpectroscopyandSpectralAnalysis圆二色谱研究Asp44在稳定肌红蛋白结构中的作用王静云1,刘 1,唐 1,2,包永明1,郑学仿2,安利佳1丹乾11大连理工大学环境生命学院,辽宁大连 116024 21辽宁省高校生物有机重点实验室,大连大学,辽宁大连 116622引 言蛋白结构的稳定及正确的折叠是它们执行各种生物功能二硫键、盐键、氢键及内在二级结构的倾向性对蛋白结构的稳
3、定至关重要[1,2]。长期以来人们认为蛋白表面的氨基酸残基暴露在溶剂中,对蛋白的稳定性影响甚微。但最近几年研究成果对这一观念提出了质疑,发现蛋白表面带电氨基酸残基对蛋白的稳定性及性质具有非常大的影响,从而开辟了通过优化蛋白表面电荷与电荷的作用来调节蛋白结构稳定性及功能的新思路[325]。肌红蛋白(Mb)是由一条含有153个氨基酸残基的多肽链和辅基血红素组成的。在生物体中担负着重要的储存氧和促进氧在细胞中扩散的生理功能[6]。尽管有关氨基酸残基对肌红蛋白稳定性及性质的影响已有很多报道,但大都集中在研究抹香鲸肌红蛋白血
4、红素周围氨基酸或疏水氨基酸的作用[729]。作者前期的研究[10]发现当将马心肌红蛋白表面44位氨基酸从天冬氨酸突变为赖氨酸后,突变肌红蛋白与细胞色素b5之间的电子转移速率提高了一个数量级,但这一蛋白表面氨基酸对马心肌红蛋白结构稳定性的作用未见报道。各种光谱学的方法是研究蛋白结构、功能的重要手段[11214],由于圆二色谱法可以研究在不同条件下蛋白二级结构折叠状态 收稿日期:2006211218,修订日期:2007202226的基础。大量的实验结果及理论计算表明:疏水核的堆积、基金项目:国家自然科学基金项目(202
5、71010)和教育部留学归国人员启动基金项目资助作者简介:王静云,女,1967年生,大连理工大学环境生命学院副教授 2mail:wangjingyun@dl1cne摘 要为了了解肌红蛋白Mb分子表面44位天冬氨酸对稳定肌红蛋白结构的影响,用PCR定点突变的技术将肌红蛋白(Mb)基因上的第44位天冬氨酸的密码子GAT突变成赖氨酸的密码子AAA,获得突变体D44K基因,将突变体基因克隆在肌红蛋白表达质粒pGYM上,转化大肠杆菌BL21,突变蛋白D44K在大肠杆菌中大量表达,收集菌体。酶法裂解细菌,依次用硫酸铵沉淀、
6、离子交换柱层析、凝胶柱层析分离纯化得突变肌红蛋白D44K。用圆二色谱分别研究野生型肌红蛋白及其突变体(D44K)的耐热及耐酸的变性过程。实验结果表明:用碱性氨基酸Lys取代酸性氨基酸Asp44残基,增强了肌红蛋白耐热变性能力,导致蛋白质的热变性中点温度Tm由7119℃增加到7511℃,但对肌红蛋白耐酸变性的能力影响不大。关键词 肌红蛋白;定点突变;圆二色谱;蛋白质结构;结构稳定性中图分类号:Q51814 文献标识码:A 文章编号:100020593(2008)0220426204的变化[15217],因此为了
7、进一步探讨蛋白表面氨基酸在蛋白质结构稳定性中发挥的作用,本文用圆二色光谱初步探讨马心肌红蛋白突变体D44K的蛋白结构稳定性。1 实验部分DNA连接酶、DNA聚合酶、I和BamHI限制性内切酶等Pst购自大连宝生物公司。含有编码野生型马心肌红蛋白基因的表达质粒pGYM,由美国NorthwesternUniversity,B1M1Hoffman教授惠赠。其他化学试剂均为分析纯,所有的溶液均用MilliporeQ水配制。实验仪器:圆二色谱仪(JascoJ2810Spectropolarimeter),温度控制器(aJul
8、abotemperaturecon2troller),JascoV2560UV2VisSpectrophotometer,蛋白分离层析系统AKTAexplorer100(Pharmacia)。112 实验方法11211 突变蛋白(D44K)的制备设计突变引物Lys442Mb2F5‘GGCGTCTGAAAAACTGAAAAAA3′Lys442Mb2R5′TTT
