叶绿体的提取.doc

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1、叶绿体的分离原理：研磨叶片得到的匀浆，经过滤、离心可制备叶绿体。叶绿体的被膜比较脆弱，分离叶绿体应在等渗的缓冲液溶液中，0~4度温度下进行。叶绿体活力会随着离体时间延长而不断下降，因此，分离工作尽可能在短时间内完成。仪器与用具：冰箱；离心机；扭力天平；显微镜；pH计；研钵；量筒；移液管；离心管；脱脂纱布等。分离器皿都须在0度下预冷。试剂：1.分离介质：含0.33mol/L山梨醇，50mmol/LTris-HCl（或Tricine）pH7.6，5mmol/LMgCl2，10mmol/LNaCl，2mmol/L

2、EDTA，2mmol/L异抗坏血酸纳。配法：称60g山梨醇、6.06gTris、1gMgCl2·6H2O、0.6gNaCl、0.77gEDTA-Na2、0.4g异抗血酸钠，溶解后用1mol/LHCl调pH至7.6，定容至1000ml。2.悬浮和测定介质Ⅰ：0.66mol/L山梨醇，2mmol/LMgCl2，2mmol/LMnCl2，4mmol/LEDTA，10mmol/L焦磷酸钠，100mmol/LTris-HClpH7.6。配法：称60g山梨醇、0.2gMgCl2·6H2O、0.2gMnCl2·4H2O、

3、0.75gEDTA-Na2、2.23gNa4P2O7·10H2O、6.06gTris，溶解后用1mol/LHCl调pH至7.6，定容至500ml。3.悬浮和测定介质Ⅱ：测定介质Ⅰ稀释1倍。方法：1.选用生长健壮，最好是连续几个晴天下生长的菠菜叶片，洗净后去除中脉，放入0~4度冰箱或冰瓶中预冷。2.分离介质30~50ml，置于研钵中，并在冰箱中预冷至现薄冰。3.取冷却的菠菜叶片10~20g，撕碎后放入研钵，用手工快速研磨0.30~1min，注意不要用力过猛，也不必研磨过细，以叶片磨成小块时即可，研磨后将匀浆用

4、两层新纱布过滤。4.将滤液装入预冷过的两个离心管，经天平平衡后，用离心机以1000r/min离心2min。5.倾去上层液，沉淀即为叶绿体。随后每管加2ml悬浮和测定介质Ⅱ，并用吸管冲散沉淀。叶绿体悬浮液合并后放冰瓶中备用。6.用滴管吸取少量叶绿体，加少量悬浮和测定介质Ⅱ稀释，置显微镜（400~600倍）下，观察叶绿体的形态。叶绿体被膜完整度的测定原理：由于铁氰化钾不能透过被膜，故完整叶绿体在等渗介质中不能进行铁氰化钾光还原的Hill反应。而失去完整被膜的叶绿体，铁氰化钾可以进入类囊体进行Hill反应。而失去

5、完整被膜的叶绿体，铁氰化钾可以进入类囊体进行Hill反应。根据这一原理，比较胀破的叶绿体Hill反应速率就可以计算叶绿体被膜的完整度。仪器与用具：氧电极测氧全套装置Rubisco（RuBP羧化酶）活性的测定原理：根据Cavinl循环得知，在RuBP羧化酶作用下1molRuBP与1molCO2反应生成2mol3-磷酸甘油酸，后者在3-磷酸甘油酸激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶作用下，被NADH还原成3-磷酸甘油醛，其反应如下：RuBP羧化酶，Mg2+RuBP+CO2+H2O←—————————→2×3-PGA3-P

6、GA激酶，Mg2+2×3-PGA+2ATP←—————————→2×1，3-二磷酸甘油酸+2ADP3-磷酸甘油醛脱氢酶2×1，3-二磷酸甘油酸+2NADH←—————————→2×3-二磷酸甘油酸+2NAD++2Pi从上述总式可以看出，每固定1molCO2就有2molNADH被氧化，NADH的减少量可用分光光度计在340nm下测出，进而计算出RuBP羧化酶的活性。仪器与用具：分光光度计；冷冻离心机；自动部分收集器，蛋白质检测仪；凝胶电泳装置；Sephadex（葡聚糖）层析柱（长度与直径视所提蛋白的质量而定）

7、；恒温水浴；匀浆器；纱布。试剂：