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1、CACNA1A基因突变参与家族性偏头痛发作的机制研究张森指导教师陶金教授摘要：本项研究旨在通过调节CACNA1A编码的钙通道α1亚单位的功能而研究其参与偏头痛的发生发展，并再次验证CACNA1A是研发偏头痛治疗药物的新靶标；运用分子生物学、行为学、免疫荧光等方法深入研究CACNA1A基因突变在偏头痛中的作用；结果显示：（1）注射CACNA1A基因shRNA能有效抑制CACNA1A表达；（2）当CACNA1A基因白表达降低后，能有效减轻偏头痛症状。关键词：偏头痛CACNA1A基因基因沉默研究背景：偏头痛(Migraine)是一种反复发作的、一侧或双侧搏动性的剧烈头痛。发作时常伴
2、心率加快、面色苍白、恶心、呕吐等,发作前,常有视物模糊、闪光、偏盲、半侧面部和肢体麻木等先兆。发病率国外为12.9%～17.6%,国内为0.985%,男女比例1∶4。因本病反复发作迁延难愈,给患者造成极大的痛苦,历来被医家视为疑难病症,对本病发病机理及药物治疗成为医界关注的热点之一现代医学对本病尚未形成统一的认识,最早是1963年Wolff提出的血管源学说:认为血管舒缩功能异常是因,头痛及神经功能异常是果。但随着高新技术如头颅核磁共震等的应用,学者们重新评价了1873年Lieving提出的神经源学说,进一步提出三叉神经血管反射学说(1990年,Moskowitz提出)、皮层扩
3、布性抑制学说(CSD,1994年,Leac提出),神经源学说认为神经系统的某种缺陷,加之内外因子的刺激引起皮层(CSD)或脑干中缝核异常放电,血管活性肠肽(VIP)能神经元递质释放,三叉神经纤维支配区血管舒张,痛觉纤维传入三叉神经尾核,向上达皮层引起痛觉,向下传出末梢释放降钙素基因相关肽(cGRP)、致痛P物质(SP)、神经活性肽A(NKA),引起支配区域血管进一步扩张,血浆蛋白渗出,形成神经性炎症,又刺激痛觉纤维传入三叉神经尾核,如此形成恶性循环,头痛加重并刺激尾核细胞内早快基因c2fos、c2jun大量表达,引发细胞长期反应。三叉神经血管反射学说是目前解释本病的主流学说。
4、偏头痛是一种有明显家族聚集性的遗传与环境等共同作用的多因素疾病。有关偏头痛分子遗传学的研究是近年来的热点,但至今仍未在普通型偏头痛患者中鉴定出一致的基因。作为惟一符合孟德尔遗传规律的偏头痛亚型FHM,其易感基因首次定位于19p13CACNA1A基因,为脑特异性P/Q型钙通道α1A亚单位基因[6,7,8]。业已鉴定出该基因的15种突变型。vandenMaagdenberg等发现,敲入单纯性FHMR192Q型CACNA1A基因小鼠在Ca2+流、神经递质和皮质扩散性抑制(corticalspreadingdepression,CSD)方面均出现多种功能获得效应,其中包括小脑神经元C
5、av2.1电流密度增加、神经肌肉接头处神经传递增强和CSD阈值下降而速度加快,提示偏头痛时CSD敏感性增高和先兆可能是皮质过度兴奋所致。另外钙通道基因CACNA1A突变学说,还可解释偏头痛发生的不同病理生理学机制,如5-HT学说、CSD学说等。但迄今已进行了大量CACNA1A基因与普通型偏头痛关联的研究[10-16],尚无一致结果,而具有家族倾向的普通型偏头痛是否存在该基因突变尚不清楚。所以本研究旨在调节CACNA1A编码的钙通道α1亚单位的功能在偏头痛模型中的作用。一、材料与方法：1.1主要试剂和材料：4～6周龄ICR小鼠，雌雄不限，购自苏州大学实验动物中心免疫组化试剂盒，
6、DAB显色剂，Trizol总RNA提取试剂购自Sigma公司，cDNA第一链合成试剂盒和PCR扩增试剂盒购自上海生丁生物工程公司，P/Q型钙通道一抗购于santacruz，shRNA购自上海吉玛制药技术有限公司，FITC(异硫氰酸)标记的羊抗小鼠IgG购于北京中杉金桥生物制品有限公司。1.2实验方法1.2.1建立偏头痛模型：小鼠皮下注射硝酸甘油注射剂10mg/kg造模1次,。造模后3min左右,动物出现双耳发红、前肢频繁挠头、爬笼次数增多、烦躁不安等现象。此现象持续约3小时,继而出现蜷卧,活动减少状态,表明偏头痛动物模型复制成功。1.2.2将建立偏头痛模型成功的ICR小鼠随机
7、分为两组，即实验组和对照组，实验组定位注射慢病毒包装的shRNA15μl，对照组注射生理盐水5μl，2小时之后进行明暗箱及滚筒实验。1.2.3明暗箱实验：将小鼠放于明暗箱的暗箱中，记录10分钟内其出现在明箱里的总次数1.2.4滚筒实验将小鼠放于滚筒中令其自由跑动以带动滚筒转动，并记录其从滚筒钢条间隙失足掉下前的潜伏时间。1.3WesternBlot检测钙通道蛋白表达1.3.1取4-6周龄的ICR小鼠（L4-L6）的背根神经节，在可视显微镜下将组织剪碎加入适量细胞裂解液，超声细胞破碎仪低温匀浆后4℃裂解3
