血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳.pdf

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1、血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳【目的】1.掌握血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳的原理2.掌握电泳对血浆脂蛋白分类方法、类型3.了解血浆脂蛋白的性质、特点【原理】1.琼脂糖（agarose）是经过挑选，以质地较纯的琼脂（agar）作为原料而制成的。琼脂在化学上是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物。琼脂胶是一含有硫酸根和羟基的多糖，它具有离子交换性质，这种性质会给电泳及凝胶过滤以不良的影响。琼脂糖是直链多糖，它由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成。琼脂糖主要通过氢键而形成凝胶。电泳时因凝胶含水量大（98%～99%），近似自由电泳，因为固体支持物的影响少，故电泳速度快，区带整齐

2、。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响少，是一种较好的电泳材料，分离效果好。血清中脂类物质是与血清载脂蛋白结合成水溶性的脂蛋白（lipoprotein）形式存在。各种脂蛋白中所含载脂蛋白的种类及数量不同，各种脂蛋白颗粒大小也相差很大，因此，以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分离开来。琼脂糖凝胶电泳分离血清蛋白方法简单。将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑（或油红等）进行预染。再将预染过的血清加样于琼脂糖凝胶板加样槽中，通电后可以看到脂蛋白向正极移动，并分离出几个区带。2.血清脂蛋白分类正常人血清脂蛋白可出现三条区带,从阴极到阳极依次为β-脂蛋白(最深)、前β-脂

3、蛋白(最浅)、α-脂蛋白(比前β-脂蛋白略深些),在原点处应无乳糜微粒。有时前β-脂蛋白也显示不出来。按照电泳分类法从前往后依次为：（+）α-脂蛋白，前β-脂蛋白，β-脂蛋白和乳糜颗粒（-）3.血清脂蛋白电泳的实质是对血清中的蛋白质进行琼脂糖电泳，并不仅仅是对脂蛋白进行的电泳，但由于苏丹黑染料只对染疏水性的脂类物质，脂蛋白中含有大量脂类，因此电泳的结果显示的只是脂蛋白染色带。脂蛋白在血清中含量及其脂类物质的组成量不同，染色结果带的宽窄、颜色深浅均不同。【操作方法一】1、血清制备空腹抽取正常人的血，迅速移至离心管中，室温放置1h左右，3000r/min离心10分钟，取血清。

4、注意：雪中加抗凝剂离心得到的为血浆2、预染血清取10ml血清和1ml苏丹黑染色液混合，置于37℃水浴染色30分钟,2000r/min离心10分钟，取上层溶液，下层残渣弃去。注意：如染色不行，可过夜3、制备琼脂糖凝胶板取1g琼脂糖，加凝胶缓冲液200ml，微波炉高温融化,冷却至50～60℃时，用吸管吸取胶液浇注载玻片不要使其溢出即可，静止至凝固态。4、点样将剪好的滤纸条对折，用手捏一捏折痕，使其锋利，距凝胶边缘2厘米的地方切一狭缝，用毛细管黏取羽然好的血清点在切口处，稍等片刻。5、电泳将凝胶板平行放入电泳槽中,两端搭上湿润的纱布，接上电源，每板电流3～4mA，直至脂蛋白分出

5、清晰条带为止。【操作方法二】1、凝胶制备参照下表比例并适当增减，称量琼脂糖，转入三角坪（没有广口瓶的情况下）或广口瓶内，加入TAE或TBE，用微波炉或沸水浴中融化。注意：熔化后不要马上开盖，以防水分蒸发，升高凝胶浓度琼脂糖0.1g0.2g0.4g0.8gTAE或20ml40ml80ml160mlTBE凝胶浓度0.5%0.5%0.5%0.5%2、用胶带封住电泳槽两端，插入梳子，水平放置。3、上述凝胶冷却至50～60℃时导入电泳槽，待凝固后，取出梳子，加入适量电极缓冲液使胶板浸没在缓冲液下大约1mm处。注意：拔梳子时要小心4、样品制备与加样：依据每齿孔大小用微量加样器可加样5

6、～50μl不等。注意：样品加在阴极（-）（黑色），一般位于右侧5、恒压电泳：一般电压为5～15V/cm。对大分子的分离可用电压5V/cm。直至脂蛋白分出清晰条带为止。【试剂】1.血清注意：新鲜的与长期存放的血清，脂蛋白组成不同2.苏丹黑将2g苏丹黑B驾到60ml吡啶和40ml醋酸酐，混合，放置过夜，再加3000ml蒸馏水，乙酰苏丹黑即析出，至布氏漏斗中抽滤，再将滤出结晶物溶于丙酮，蒸发丙酮，得乙酰苏丹黑粉末结晶，将乙酰苏丹黑粉末溶于无水乙醇中，使其成为饱和溶液。3.电极缓冲液称取巴比妥安钠30.8g、巴比妥5.52g及EDTA0.29g，加蒸馏水至2000ml。4.凝胶缓

7、冲液称取2.42g、NaCl11.7g及EDTA0.58g，用蒸馏水稀释至2000ml。5.琼脂糖凝胶按下表比例配制，用微波炉或沸水浴中融化。琼脂糖0.1g0.2g0.4g0.8g……TAE或TBE20ml40ml80ml160ml……凝胶浓度0.5%0.5%0.5%0.5%0.5%【器材一】1.电泳槽2.纱布3.载玻片（凝胶板）4.毛细管5.电泳仪6.滤纸条【器材二】1.电泳槽2.电泳仪3.梳子4.10～50μl的微量加样器【思考题】1.饭后马上取血染色，电泳后，可观察到脂蛋白有几种类型？2.长期存放的血清电泳脂蛋白能分几条