酶与蛋白质工程 第9章 固定化酶与固定化细胞课件.ppt

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1、第九讲固定化酶与固定化细胞固定化酶(ImmobilizedEnzyme)20世纪60年代发展起来的一项新技术以往使用的酶绝大多数是水溶性酶。这些水溶性酶催化结束后,极难回收,因而阻碍了酶工业的进一步发展60年代后,在酶学研究领域内涌现出固定化酶。通过物理的或化学的手段,将酶束缚于水不溶的载体上,或将酶束缚在一定的空间内,限制酶分子的自由流动,但能使酶充分发挥催化作用曾称其为水不溶酶或固相酶。1971年第一届国际酶工程会上正式建议采用固定化酶的名称从60年代起,固定化酶的研究发展很快,起初人们把注意力集中在酶的固定化方法研究上,近来,不但固定化方法和载体开发有了长足发展,并且已转向它在工业

2、、医药、化学分析、亲和层析、环境保护、能源开发以及理论研究等方面的应用研究固定化酶固定化酶与水溶性酶比较具有以下优点:(1)极易将固定化酶与底物、产物分开;产物溶液中没有酶的残留,简化了提纯工艺(2)可以在较长时间内反复使用,有利于工艺的连续化、管道化(3)酶反应过程可以严格控制,有利于工艺自动化和微电脑化(4)在绝大多数情况下提高了酶的稳定性(5)较能适应于多酶反应(6)酶的使用效率提高,产物得率提高,产品质量有保障,成本低固定化酶固定化酶也存在一些缺点:(1)酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本,使工厂开始投资大(2)比较适应水溶性底物和小分子底物(3)与完整细胞比较

3、,不适于多酶反应,特别是需要辅因子的反应。同时,对胞内酶需经分离后才能固定化固定化酶酶的固定化方法吸附法;共价结合法;交联法;包埋法固定化酶吸附法吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法物理吸附法:通过氢键、疏水作用和π电子亲和力等物理作用,将酶固定于水不溶载体上,制成固定化酶①有机载体,纤维素、骨胶原、淀粉等如,用纤维素作为吸附剂吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶。吸附后在载体表面形成单分子层,吸附蛋白能力约70mg/cm2②无机载体,氧化铅、高岭土、多孔硅、多孔玻璃等如,用多孔硅为载体吸附淀粉酶,在45℃进行固定化,用高浓度底物进行连续反应。无机载体的吸附容量较低、而且酶

4、容易脱落固定化酶(2)离子交换吸附法:将酶与含有离子交换基的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法酶吸附较牢,在工业上具广泛用途常用载体:①阴离子交换剂,二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类(ECTEDLA)-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶②阳离子交换剂,羧甲基(CM)-纤维素、纤维素柠檬酸盐固定化酶通过酶蛋白化学修饰增加蛋白质分子上电荷,能有效的克服吸附法制备的固定化酶在使用过程的解吸如,用乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶,可以用DEAE-纤维素载体有效固定。这种固定几乎是不可逆的吸附此外,酶的吸附与解吸还与介质中离子强度

5、、pH、温度、蛋白质浓度及酶和载体的特性相关pH的变化影响到载体和酶的电荷,从而影响载体对酶的吸附。在等电点两侧(±1-2pH单位)吸附将明显减少盐可以促进蛋白质的吸附,即所谓盐析吸附对蛋白质吸附来说,随温度的升高吸附下降载体的表面积、多孔性及其预处理都影响对酶的吸附固定化酶吸附法制备固定化酶操作简单,可充分选择不同电荷、不同形状的载体,吸附过程可以同时纯化酶,固定化酶在使用过程失活后可重新活化,同时,载体可以回收再利用但由于有些机理不十分明了,在给酶量、吸附程度与固定化酶活力回收的关系不可预见性大,同时由于吸附法制备的固定化酶易脱落,影响产物纯度和酶的操作为稳定性固定化酶交联法利用双功

6、能或多功能试剂,在酶分子间或酶与载体间进行交联反应,以制备固定化酶的方法最常用的交联试剂是戊二醛,用戊二醛交联制备固定化酶的反应如下:固定化酶交联方法:(1)交联酶法在一定条件下,加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液中,生成不溶性固定化酶如:木瓜蛋白酶在0.2%酶蛋白浓度、2.3%戊二醛、pH5.2-7.2、0℃下交联24h,可形成固定化酶这种方法也用于制备交联的结晶酶。交联结晶酶仍具有一定酶活力如:将500mg酶溶于5m10.2mol/L醋酸缓冲液中,在搅拌下滴加2m12.5%戊二醛,在室温下放置10-30min,会有沉淀析出,1-3h内反应结束。形成的凝胶切碎后水洗,除多余戊二醛,即为固定

7、化酶固定化酶(2)载体交联法用多或双功能试剂的一部分功能基团与载体交联,另一部分功能基团与酶蛋白交联而制备固定化酶的方法单用戊二醛等试剂交联制备的固定化酶活力较低,常将此法与吸附法、包埋法结合使用,可以达到既提高固定化酶的活力,又起到加固的效果固定化酶共价结合法酶蛋白侧链基团和载体表面功能基团之间形成共价键而固定的方法其优点:酶与载体结合牢固,酶不易脱落,但反应条件较激烈,酶易失活,同时,制作手续亦较繁琐酶分子和载体连接的功能基团从

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