酶分离纯化的评价课件.ppt

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1、第二章酶的生产与分离纯化(2学时，共4学时)主要内容酶分离、纯化的评价酶的剂型与保存酶的分子结构与催化功能4酶分离、纯化的评价酶经分离、纯化后要确定该纯化步骤是否适宜，必须经过对有关参数的测定及计算才能确定。酶的产量是以活力单位表示，因此在整个分离过程中每一步始终贯穿比活力和总活力的检测、比较。基本概念1酶活力(Enzymeactivity)：酶活力是指酶催化反应的能力，它表示样品中酶的含量。1961年国际酶学会规定：lmin催化lμmol分子底物转化的酶量为该酶的一个活力单位(国际单位)，温度为25℃，其它条件(pH、离子强度)采用最适条件。重要酶的总活力为样品的全部酶活

2、力。总活力=酶活力×总体积(mL)或=酶活力×总质量(g)比活力(Specificactivity)：比活力是指单位蛋白质(毫克蛋白质或毫克蛋白氮)所含有的酶活力(单位/毫克蛋白)。比活力是酶纯度指标，比活力愈高表示酶愈纯，即表示单位蛋白质中酶催化反应的能力愈大。但是，比活力仍然是个相对酶纯度指标。要了解酶的实际纯度，尚需采用电泳等测定方法。回收率(Yieldpercent)：回收率是指提纯前与提纯后酶的总活力之比。它表示提纯过程中酶的损失程度，回收率愈高，其损失愈少。提纯倍数：提纯倍数是指提纯前后两者比活力之比。它表示提纯过程中酶纯度提高的程度，提纯倍数愈大，提纯效果愈佳

3、。酶纯化评价实例5酶的剂型与保存酶制剂通常有下列四种剂型：液体酶制剂固体粗酶制剂纯酶制剂固定化酶制剂（见书中第五章）5.1液体酶制剂包括稀酶液和浓缩酶液。一般除去固体杂质后，不再纯化而直接制成，或加以浓缩而成，一般需要加稳定剂。这种酶制剂不稳定，且成分复杂，只用于某些工业生产。5.2固体粗酶制剂发酵液经杀菌后直接浓缩或喷雾干燥制成。有的加入淀粉等填充料，用于工业生产。有的经初步纯化后制成，如用于洗涤剂、药物生产。用于加工或生产某种产品时，务须除去起干扰作用的杂酶，才不会影响质量。固体酶制剂适于运输和短期保存，成本也不高。5.3纯酶制剂包括结晶酶，通常用作分析试剂和医疗药物。

4、要求较高的纯度和一定的活力单位数。用作分析工具酶时，除了要求没有干扰作用的杂酶存在外，还要求单位质量的酶制剂中酶活力达到一定的单位数。用作基因工程的工具酶要求不含非专一性的核酸酶，或完全不含核酸酶，酶的保存方法(1)温度。(2)pH与缓冲液。(5)为提高酶稳定性，常加入下列稳定剂：①底物、抑制剂和辅酶，它们的作用可能是通过降低局部的能级水平，使酶蛋白处于不稳定状态的扭曲部分转入稳定状态。②对巯基酶，可加入－SH保护剂。如二巯基乙醇、GSH(谷胱甘肽)、DTT(二硫苏糖醇)等。③其他如Ca2+能保护α－淀粉酶，Mn2+能稳定溶菌酶，Cl－能稳定透明质酸酶。(3)酶蛋白浓度。(

5、4)氧。6酶的分子结构与催化功能6.1酶分子组成1.酶蛋白虽然少数有催化活性的RNA分子已经鉴定，但几乎所有的酶都是蛋白质。酶蛋白有三种组成形式：①单体酶，仅有一个活性部位的多肽链构成的酶分子质量为13～35kDalton，为数不多，且都是水解酶；②寡聚酶，由若干相同或不同亚基结合而组成的酶，亚基一般无活性，必须相互结合才有活性，分子质量为35kDalton以上到数百万单位；③多酶复合体，指多种酶进行连续反应的体系。前一个反应产物为后一反应的底物。2.辅基或辅酶仅有少部分酶是由单一蛋白质所组成，而大部分酶则为复合蛋白质，或称全酶，是由蛋白质部分(酶蛋白)和非蛋白质部分所组成

6、，即酶蛋白本身无活性，需要在辅因子(Cofactor)存在下才有活性。有机辅因子可依其与酶蛋白结合的程度分为辅酶(Prostheticenzyme)和辅基(Prostheticgroup)。（1）铁卟啉铁卟啉是细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等氧化酶的辅基。氧化酶的铁卟啉的功能在于靠铁的价电子变化（Fe2+→Fe3++ｅ）来传递电子，催化氧化还原反应。（2）黄素核苷酸(FMN和FAD等)黄素核苷酸为维生素B12(核黄素)的衍生物，为黄素酶类(如氨基酸氧化酶、琥珀酸脱氢酶等)的辅基。在酶的催化作用下，FMN和FAD的功能是传递氢(传递质子和电子2H→2H++2e)，亦称

7、氢载体而自成氧化－还原体系，反应主要表现在6,7－二甲基异咯嗪基团中的第1位及第10位N原子的脱氢与加氢。其反应式如图3－3。（3）烟酰胺核苷酸(NAD及NADP)烟酰胺核苷酸是许多脱氢酶(如异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、乙醇脱氢酶等)的辅酶。主要有两种：烟酰胺腺膘呤二核苷酸(NAD、辅酶Ⅰ)和烟酸胺腺膘呤二核苷酸磷酸(NADP、辅酶Ⅱ)。NAD及NADP在脱氢酶催化过程中参予传递氢的作用，其氧化还原作用体现在烟酰胺环的第4位碳原子上的加氢或脱氢。在中性环境中其氧化还原的反应式如图3－5。（4）硫辛酸(6，8－二硫