重组DNA的基本原理课件.ppt

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1、第40章、重组DNA技术1.目的基因的获取2.克隆载体的选择与构建3.外源基因与载体的连接4.重组DNA导入受体菌5.重组体的筛选6.克隆基因的表达(一)目的基因的获取化学合成法基因组DNAcDNA聚合酶链反应基本概念基因（gene）：P219基因组（genome）：P292基因组学（genomics）：研究基因组的结构、信息与功能的科学。基因组计划：HGP——P440后基因组功能基因组基因文库基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)聚合酶链反应（PC

2、R）PolymeraseChainReaction基本原理：变性、退火、延伸(二)克隆载体的选择和构建质粒DNA克隆载体噬菌体DNA病毒DNA(三)外源基因与载体的连接连接策略1.粘端DNA间的连接(1)同一限制性内切酶切割位点连接(2)不同限制性内切酶切割位点连接2.平端DNA间的连接3.同聚物加尾连接4.人工接头连接(四)重组DNA分子导入受体菌无性繁殖感受态细胞:容易接受外源DNA的状态.方式:转化、转染、感染导入大肠杆菌1.氯化钙转化法2.电击法3.体外包装感染法导入哺乳动物细胞1.显微注射法2

3、.电穿孔法3.DNA-磷酸钙共沉淀4.DEAE-葡聚糖转染法5.病毒感染法6.脂质体介导法7.细胞融合法8.原生质体融合法9.微细胞介导法(五)重组体的筛选直接选择法1.抗药性选择2.标志补救3.分子杂交法间接筛选法核酸水平*1.酶切图谱*2.核酸探针*3.PCR*4.序列测定蛋白质水平免疫学的技术：SDS-PAGE、Westernblot、ELISA、放免、免疫沉淀、荧光抗体等(六)克隆基因的表达原核表达体系——表达载体的标准：1.含有大肠杆菌适宜的选择标志2.具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动

4、子3.含有适当的翻译控制序列4.含有合理设计的多接头克隆位点真核表达体系关键步骤是将重组DNA导入真核细胞DNA克隆的基本过程分：分离目的基因切：对目的基因和载体适当切割接：目的基因与载体连接转：重组DNA转入受体菌筛：筛选出含有重组体的受菌体基因工程技术策略分：基因载体目的基因质粒噬菌体病毒直接分离cDNA人工合成基因文库切：限制性内切酶有缺口的载体目的基因接：连接酶粘端连接平端连接尾接法重组体转：转化转染体外包装带重组体的宿主筛：表型筛选电泳法核酸杂交基因工程技术与医学的关系1.生命科学研究的趋势2

5、.疾病基因的发现3.发展生物制药4.基因诊断与基因治疗5.遗传病的预防基因工程的目的醫學用途:超過１００種基因治療法已經在全球推行改善農業:糧食產量大增，解決飢荒；抵抗病蟲害，耐寒耐旱，防止早熟和腐爛，保存期更長。稀有動物的保育:拯救瀕臨絕種的動物其他:政治用途、經濟用途、娛樂用途等。转基因作物，目前最常见的是转入抗除草剂基因，这样的转基因作物可以抵抗普通的、较温和的除草剂，因此农民用这类除草剂就可以除去野草，而不必采用那些毒性较强、较有针对性的除草剂。其次是转入抗虫害基因，用得最多的是从芽孢杆菌克隆出

6、来的一种基因，有了这种基因的作物会制造一种毒性蛋白，对其他生物无毒，但能杀死某些特定的害虫，这样农民就可以减少喷洒杀虫剂。据统计，在过去的四年内，美国由于推广抗虫害转基因作物，少喷洒了270万磅的杀虫剂。转基因作物还能增加产品，例如抗虫害转基因玉米能增产5－15％。转基因技术也可用于改变食物的营养成分，例如减少土豆的水分，这样炸出来的土豆片更脆；降低植物油中的不饱和脂肪酸，能延长储存期限。转基因西红柿不仅容易运输、保存，而且味道也更佳。菲律宾的国际水稻研究院正在试验“金水稻”，通过转基因技术让水稻制造贝

7、塔胡萝卜素（维生素A的前体），有助于消灭在亚洲地区广泛存在的维生素A缺乏症。转基因技术也可提高水稻中铁元素的含量，以减少亚洲妇女常见的贫血症。转基因作物的历史很短。1992年，中国种植了世界上第一批商用转基因作物－－转基因烟草。1994年，美国市场上才首次出现了转基因食品，一种软化缓慢的西红柿。由于转基因作物的巨大优势，推广非常快。到2000年，全世界已有4420万公顷的土地种植转基因作物，其中美国占68％，阿根廷占23％，加拿大占7％，中国占1％，其他国家占1％。大豆、玉米、棉花和油菜是主要的转基因作

8、物，在美国，有近一半的大豆、棉花，超过三分之一的玉米、油菜是转基因作物。美国超级市场上的食物制品中，约60％含有转基因的成分。在公众的反对声中，目前这个发展势头已缓慢下来，特别是在工业化国家，转基因作物的种植面积有减少的趋向。美国虽然还没有限制转基因作物，但是由于美国是农产品出口大国，欧洲、日本对转基因作物进口的限制，也打击了美国农民的积极性。Transgenictobaccoplantwithgeneforfireflyluciferas