真菌蛋白提取方法.doc

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1、真菌蛋白提取方法一TCA/丙酮法1液氮将菌体研磨为粉末；2向匀浆中加入10倍体积的丙酮（含13.3%(w/v)TCA和0.093%β巯基乙醇），过夜沉降；34度20,000g离心15min；4移处上清，用冰冷的含0.07%(v/v)β－巯基乙醇的丙酮清洗沉淀两次；5离心后，沉淀干燥至丙酮挥发完全。二酚抽提法1在液氮中将1g菌体研磨为粉末2加入6ml水饱和酚（buffer-saturatedphenol）和2ml提取液（20mMTris-Cl,pH7.5,0.5%TritonX-100(v/v),0.5MEDTA,

2、pH7.5,pH8.0,0.07%β－巯基乙醇,proteaseinhibitors）。3在4度混合30分钟。412000rmp离心1min，使两相分开。5弃沉淀，吸取上层的苯酚相，加入5倍体积的冷丙酮，-20度沉降2h。612000rmp，4度，离心15分钟沉淀蛋白，弃去上清。7沉淀干燥至丙酮挥发完全。三提取液抽提丙酮沉淀法1预先将研钵置于－20℃的冰箱内冷冻。2取液氮冻存的菌体，放入预冷的研钵内研磨至粉末状。3向匀浆中加入2倍体积的抽提液（20mMTris-Cl,pH7.5,0.5%TritonX-100(v

3、/v),0.5MEDTA,pH7.5,pH8.0,0.07%β－巯基乙醇,proteaseinhibitors）。4混匀后4度震荡30分钟，以便蛋白溶解。512000rmp，4度，离心15分钟，吸取上清于另一EP管中。7向上清液中加入5倍体积的预冷丙酮（含有0.07％β－巯基乙醇），混匀，－20℃，2小时沉淀蛋白质。812000rmp，4度，离心15分钟沉淀蛋白。弃去上清，沉淀用乙醇洗三次，自然干燥蛋白沉淀。四甲醇氯仿水沉淀法Chloroform/Methanol/WaterPrecipitation1预先将研钵

4、置于－20℃的冰箱内冷冻。2取液氮冻存的菌体，放入预冷的研钵内研磨至粉末状。3向匀浆中加入4ml的抽提液（20mMTris-Cl,0.5%TritonX-100(v/v),0.5MEDTA,pH8.0,0.07%β－巯基乙醇,proteaseinhibitors）。412000rmp，4度，离心10分钟，吸取上清于另一离心管中，尽量少吸上层色素。5重复第4步。6加入16ml的预冷甲醇，涡旋，4度静置5分钟，7加入8ml预冷氯仿，涡旋，4度静置5分钟，8为使相分层，加入12ml水，剧烈混合，4度静置30分钟，860

5、0g离心1min9移除上层水相10向下层氯仿相和中间蛋白沉淀加入12ml预冷甲醇，充分混合后，转入2.0ml离心管中，9000g离心5min沉淀蛋白。11去上清，再加入1ml甲醇：氯仿=3：2溶剂清洗蛋白一次，干燥蛋白沉淀，保存至使用。