荧光实时定量PCR课件.ppt

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1、荧光实时定量PCR基本概念化学光学原理等位基因鉴定原理4123数学原理基本概念1PCR-链式反应的雪崩效应典型PCR的四个阶段Base实时荧光定量PCRReal-timePCR/quantitativePCR(qPCR)PCR扩增反应中，引入一种荧光化学物质，对每一个循环产物荧光信号的实时检测可以得到荧光扩增曲线实现对起始模板定量和定性分析Real-timePCRVSPCR荧光物质激发光发射光滤光片检测（观察）两种定量化学染料染色SYBRGreenI是一种DNA小沟结合染料与DNA双链结合时发光游离时不发光PCR过程中染料掺入：信号强度与双链DNA分子数正比熔解

2、曲线PCR过程结束，可控制温度缓慢升高(60octo95oc,0.2oc/sec)dsDNA解链成为ssDNA,SYBRGreenI被释放，荧光信号消失熔解曲线将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT)原始图谱对数图谱Tm值：50%DNA变成单链时的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量有关，可部分代表序列的特异性Tm融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确熔解曲线染料的特点探针标记Taqman探针一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增有关。探针5’端连接荧光基团，3’端连接淬灭基团。利用了P

3、CR延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性，使荧光基团和淬灭基团分离。热变性，配对聚合酶，延伸信号强度与结合探针的DNA分子数成正比荧光共振能量转移(FRET)Oligo1:FluoresceinOligo2:LCRed640ExcitationEmissionTransfer10nm分子信标TaqMan探针的衍生——发夹型杂交探针形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针发夹结构的两端分别连接荧光基团和淬灭基团。利用分子构象的改变使得荧光基团和淬灭基团分开。探针的特点不同定量方法的比较3数学原理横坐标：扩增循环数（Cycle）纵坐标：荧光强度每个循环延伸步骤进行一次荧光信号

4、的收集扩增曲线图理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率在扩增产物达到定值M时:XC=X0(1+Ex)C=MlogM=logX0(1+Ex)C整理得:logX0=-log(1+Ex)*C+logMC：产物到M值的循环数logX0=-log(1+Ex)*C+logMM:阈值C-Ct：产物到阈值的循环数LogX0（初始模板量）与Ct线性关系:Ex相对恒定相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定，指数期Ct值则极具重现性结论在荧光信号的指数期一定阈值下的循环

5、数（Ct）与样品起始浓度成线性相关不同样品间扩增效率的相对差异小同一样品不同次的扩增效率的相对差异小等位基因鉴定原理4双探针法小结实时荧光定量PCR的概念以及用途实时荧光定量PCR的化学光学原理实时荧光定量PCR的数学原理