荧光定量业务员培训课件.ppt

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1、荧光定量PCR技术及应用BY实时荧光定量PCR技术所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。能量跃迁荧光荧光共振能量转移一、重要概念:二、荧光的产生原理:(以有代表性的Taqman/MBG探针法及分子信标技术为例):1.Taqman探针技术:PCR扩增时在

2、加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。2.MGB探针技术MGB技术原理与Taqman技术基本相同,差别在于MGB探针3’端的淬灭基团采用了非荧光性淬灭基团,淬灭基团吸收报告基团的能量后,不发光,大大降低了本底信号的干扰。另外MGB探针的

3、3’端增加了一个DPI3基团,可大大稳定探针与模板的杂交,使得探针可以设计得更短,以提高淬灭基团的淬灭效果,并大大简化了探针设计。3.分子信标技术:Tyagi和Krammer于1996年设计了一种可以特异性识别核酸序列的新型荧光探针,这种荧光探针通过与核酸靶分子进行杂交后发生构象的变化而发出荧光,他们将其命名为分子信标。无靶标存在下,茎环结构使得荧光基团和猝灭基团相互靠近,发生荧光共振能量(FRET)转移,荧光猝灭,荧光背景极低。加入靶序列后,分子信标与完全互补靶序列形成刚性并且更加稳定的双链杂交体,使得荧光基团和猝灭基团距离增大,阻止了FRET的发生,荧光恢复。三、荧光

4、定量PCR的数学模型:在实时荧光PCR中,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,CT值越小。利用已知起始拷贝数的外部标准品可做校正曲线。因此只要获得未知标本的Ct值,即可从校正曲线上计算出该标本的起始拷贝数,这是采用外标进行实时荧光PCR绝对定量的基本原理:logX=-Ct×log(1+E)+logYct四、影响因素:1.扩增效率对PCR扩增的影响:扩增效率主要影响扩增扩增达到平台期时,产物的量。在同一PCR仪中,每个孔加热温度,加样和试剂都可能存在偏差,结果导致各孔的扩增效率存在差异。但由于荧光定量PCR采用的是起点定量而非终点定量,故

5、只要扩增效率不是过低,均不会影响结果分析。同时扩增96个相同样品的结果2.基线设定及其对阈值和Ct的影响:基线就是扩增曲线中的水平部分。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,一般荧光阈值的设置是在基线(背景)荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应罐内的荧光信号达到所设定的阈值时所经历的循环数被称为Ct值。3.对样品的要求:DNA纯度:OD260/OD280介于1.6到2.0之间。DNA用量:0.05–100ngRNA纯度:OD260/OD280=2.0cDNA用量:1–100ng总RNA反转录的cDNA取1μl.4.对标准品

6、的要求:浓度已知5点以上标准品要与待测样品的扩增效率一致,且接近100%。不要求:不要求标准品与目的基因使用相同的DNA,可以相同,也可以不同。五、应用绝对定量:病原体检测转基因食品检测基因表达研究相对定量:基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究六、本中心的应用:肝炎系列荧光定量性病病原体荧光定量谢谢各位同事听我的讲解!电子跃迁:电子跃迁就是指原子的外层电子从低能轨道转移到高能轨道,或者从高能轨道转移到低能轨道。转移过程中会吸收或者放出一个光子,该光子能量为两个轨道能量之差的绝对值。电子跃迁分为自发跃迁和受激跃迁,在没有外界激励的情况下电子处在平衡状态下,再有外

7、界激励下,电子平衡被打破,如果电子吸收光子能量则会跳跃到离原子核更远的轨道上(光子能量大于或等于两轨道能及之差),但这样的电子不稳定,容易放出能量而返回原来的轨道,这部分放出的能量就表现为荧光。电子跃迁波尔用氢原子轨道理论成功结识了电子跃迁。该理论假设氢原子电子在某些特定的轨道上运行,每个轨道对应着一个能级,且能级是分离的。在外界光子的激发下,电子可以从低能级跃迁到高能级,其中入射光子的能量必须要大于或者等于两轨道能级绝对值之差。同时合适的光子入射下,原子电子也可以从高能级跃迁到低能级,同时放出一个光子,该光子能量与入射光子能

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