荧光定量PCR工作原理及应用课件.ppt

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1、何谓PCR简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内 (In Vitro) 的大量合成。基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。PCR的要素基本的PCR须具备１.要被复制的DNA模板 (Template) ２.界定复制范围两端的引物(Primers). ３.DNA聚合酶 (Taq. Polymearse) 4.合成的原料及水。PCR的反应包括三个主要步骤，分别是1). Denaturation 2). Annealing of primers, and 3)

2、. Extension of primers。 所谓 Denaturing乃是将DNA加热变性， 将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板. 而Annealing 则是令 Primers于一定的温度下附着于模板DNA两端。 最后在DNA聚合酶 (e.g. Taq-polymerase) 的作用下进行引物的延长 (Extension of primers)及另一股的合成。荧光PCR/实时定量PCR技术应用简介（fluorogenicquantitativePCR,FQPCR）荧光PCR原理1．荧光共振能量传递 (FRET)某荧光标记基

3、团在激发光刺激下生成某波长的发射光，当另一屏蔽基团与其距离合适时，原发射光将会被屏蔽基团所吸收，并转化为其他波长的发射光或热能，称之为FRET。2．荧光化学：荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就

4、有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。荧光信号的强弱与PCR的产物数量成正比，根据测量到的荧光信号强弱，通过分析软件得到样本的原始拷贝数。荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。扩增5’3’5’5’3’5’正向引物反向引物TaqMan®探针RQ报告荧光淬灭基团报告荧光淬灭基团置换5’3’5’5’3’5’RQ正向引物TaqMan®探针反向引物切割5’3’5’5’3’5’QR正向引物反向引物扩增完成5’3’5’5’3’5

5、’RQ正向引物反向引物Ct值C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。2.FQ—PCR的优点FQ—PCR技术是融合了PCR技术与DNA探针杂交技术的优点，实验的整个过程只在加样时打开1次反应

6、管，在PCR的每个循环中可以直接监测到荧光信号的变化，根据PCR反应酶动力学特点分析软件会自动对DNA进行定量，因此也有人称FQ-PCR为实时荧光定量PCR（Real-timequantitativePCR）。其优点为：①FQ-PCR解决了传统PCR技术不能定量和扩增产物污染的问题。②避免了普通定量PCR操作过程中的污染，FQ-PCR只在加样时打开反应管1次。③FQ-PCR操作简便、快捷、结果准确，不需要普通PCR扩增后进行电泳或放射自显影观察结果，方便了临床上应用。④FQ-PCR可以对每一批扩增样本进行扩增效率的评价。对DNA做系列稀释，每

7、个稀释浓度的DNA对数值与其Ct值做回归分析，PCR的扩增效率的计算方法为：效率=10-1/斜率。通过计算扩增效率可以对仪器、操作人员和试剂进行综合评定。7000定量原理定量PCR原理Rn(荧光信号)循环数CycleNumber线性增长期指数增长期平台期Rn(荧光信号)循环数CycleNumber域值ThresholdCt扩增曲线：域值和Ct值Ct起始拷贝数或起始浓度标准曲线7000化学原理ITaqMan®探针法7000化学原理IITaqMan®MGB探针法NFQMGBRNFQMGBR报告荧光无荧光淬灭基团Non-FluorescentQue

8、ncher小沟结合物MinorGrooveBinderTaqMan®MGB探针结构TaqMan®MGB探针特点探针较短(~13bp)较短探针提高鉴定的准确性小沟结合