荧光免疫标记课件.ppt

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1、荧光免疫标记技术免疫荧光技术（Immunofluorescencetechnique）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。该技术的主要优缺点主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。免疫荧光技术免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗

2、原。在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。免疫荧光技术-基本原理荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素是一种可吸收激发光的光便能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物，亦称荧光色素。发生原理---基态激发态产生特点：激发---即刻产生停止激发---瞬间消失种类---光致荧光，化学荧光，X线荧光，阴极射线荧光荧光荧光色素:能够产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物称为荧光色素或荧光染料。用于标记抗体的荧光色素，必须具有化学上

3、的活性基因，能与蛋白质稳定结合，且不影响标记抗体的生物活性及抗原抗体的特异性结合。异硫氰酸荧光素(FITC)荧光FITC+RB200标记光源：高压汞灯、氙灯、卤素灯滤板：隔热滤板、激光滤板（UG、BG）、吸收滤板（OG、GG）光路：透射光、落射光荧光显微镜讨论分析荧光显微镜台式机---FACSCalibur双激光---488nm635nm四荧光参数分选、浓缩系统大型机---FACSVantageSE多激光多波长八荧光参数高速分选单细胞点对点分选基本原理---荧光显微镜；荧光Ab；标本（组织或细胞中Ag)技术类型

4、：直接法---荧光素标记Ab直接检测间接法---荧光素标记二抗补体结合法---荧光素标记抗补体Ab双结合法---两种荧光素标记Ab重点荧光免疫显微技术间接免疫荧光检测自身抗核抗体FALSSensorLaser前向角散射光（FSC）：反映细胞的大小荧光免疫显微技术FALSSensor90LSSensorLaser侧向角散射光（SSC）：反映细胞内的颗粒多少荧光免疫显微技术双色直接染色细胞T细胞B细胞荧光免疫显微技术直方图分析：对细胞的某一个单参数进行统计分析横坐标为荧光或散射光强度纵坐标为细胞数荧光免疫显微技术间

5、接免疫荧光法示意图