(三)某些重要学科的研究方法.ppt

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1、包括:细胞生物学分子生物学神经科学病理学某些重要学科的研究方法Thekeytoeverybiologicalproblemmustfinallysoughtinthecell——E.B.Wilson,1925细胞生物学假如你想探索一种化学药物 有无抗癌作用细胞水平的研究对恶性肿瘤细胞生长的影响(生长曲线)2.对恶性细胞增殖的影响(分裂指数测定,成集落实验)对恶性肿瘤细胞代谢的影响(DNA,蛋白质合成的影响)4.器官培养实验动物水平的研究对致瘤动物的治疗作用2.动物的肿瘤细胞接种实验分子水平的研究对已知癌基因与抑癌基因的作用2.发现未证明的基因或抑癌基因关于对照

2、配对的细胞(SV3T3-3T3)癌细胞与正常或原代培养细胞3.癌细胞,癌旁组织细胞及正常细胞假如你想研究一种药物有无致癌作用分子生物学细胞的转化试验(细胞的选择)动物的致瘤试验(动物的选择)对癌基因,抑癌基因的分析最关心的共同问题如何从分子遗传学角度确定疾病的致病基因或易感基因?对一个感兴趣的基因,如何研究其功能?一般设计原则如何从遗传学角度确定 疾病的致病基因或易感基因?确定被研究群体:获取临床标本↓选择候选基因:从定位区域或文献报道的候选基因中选择↓多态性检测:采用测序法确定SNP或RFLP↓基因分型(genotyping):采用高通量方法对每个标本进行基

3、因分型↓单倍型分型(haplotyping):采用软件算法(PHASEalgorithm或DnaSP3.5algorithm等)、四配子试验。↓数据分析:等位基因关联分析↓单倍型关联分析对一个感兴趣的基因如何研究其功能?生物信息学分析结构域序列特点亚细胞定位相互作用蛋白参与pathway、信号途径已知某些功能及作用(重复序列、pi位点等、启动子、切接位点)例:亚细胞定位:荧光蛋白显示、免疫组化:分子相互作用:酵母双杂交、pull-down、Co-IP机理研究:细胞分子水平转染(共转染)实验RNAi反义突变实验阻断剂(抑制物)激活剂体外实验体系动物整体水平转基因

4、动物基因敲除动物疾病模型医学分子生物学实验设计中常见的毛病没有对照或不严格的对照,难以判断结果正确与否实验设计太简单,机理研究不够,影响研究水平文题不符,结论不妥实例分析目的:在整体水平上证明肝A物质参与肝B物质的合成。方法:大鼠20只,分2组喂C饲料(C为B前身物)2周后杀死取肝脏对照组喂正常饲料检测:肝D物质和A物质mRNA水平,粪B物质含量(肝B物质克分泌至粪中排出)结果:D物质和A物质mRNA粪B物质合成结论:A物质参与了B物质合成分析:①实验设计不合理,因果关系不明确②对照不全分组应增加其非前身物mRNA检测中缺内对照③建议:A基因敲除小鼠离体临床A

5、缺陷病例实例分析神经科学现代研究方法一、形态学方法束路追踪法:轴浆运输追踪、变性束路追踪、神经元质膜荧光染色化学神经解剖法:酶组织化学、免疫组织化学、免疫电子显微镜原位杂交法受体及转运体定位法神经系统功能活动形态定位法:脱氧葡萄糖法、Fos法、细胞色素氧化酶法形态学的观察法(Confocal)二、机能学方法1.神经递质释放量的测定推挽灌流脑内微透析术伏安法脑片突触体抗体微探针2.神经递质的功能测定微电泳抗体微量注射3.行为方法经典条件反射操作式条件反射三、电生理学方法细胞外记录细胞内记录脑内电刺激电压钳膜片钳脑电波诱发电位四、脑成像方法X线脑室造影X线脑血管造

6、影脑超声计算机辅助体层摄影(CT)磁共振成像(MRI)正电子发射体层摄影(PET)单光子发射计算机体层摄影(SPECT)五、其他突触体、突触体膜和突触小泡的分离与制备反相HPLC受体的放射配体结合分析法RT-PCRNorthernWesternSouthern等等病理学病理研究的范围和内容基础科学→临床医学疾病病理形态学的演变规律疾病发病机制发病机制过程中的形态变化疾病的分子改变疾病发病过程中的分子变化形态学改变和临床表现的关系病理改变在预后判断中的价值病理研究设计原则科学循证的原则合理对照的原则实事求是的原则符合统计学原则病理研究设计的要点从临床实践中发现问

7、题、提出问题用适当的科学方法研究问题实事求是总结问题,找出科学规律技术的选择依据问题决定使用的技术以问题为中心,从不同层次应用不同的技术注意细节病例——宁缺勿滥材料——准确真实细胞系——性状,明确无误组织——纯净激光捕捉单细胞显微切割精确定位

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