DNA分子标记用于中药鉴定课件.ppt

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1、DNA分子标记鉴定分子生药学molecularpharmacognosy在分子水平上研究生药的鉴定、生产和成分的一门科学，所依据的主要是生药学和分子生物学的理论和方法，是生药学的一个极富前瞻性和前景性的分支。分子生药学研究内容研究内容鉴定方面生产方面获取有效成分方面DNA分子标记鉴别药材培育选种转基因器官培养技术DNA分子遗传标记以形态学为主的生药鉴定方法(性状鉴别、显微鉴别)和理化鉴别，还不能解决所有生药的真实性鉴定问题，特别是对同属多来源生药及种内的一些变异(道地药材)、动物药等难以专属性地鉴定。学科发展的需要以及分子生物学技术的飞速发展使DNA

2、分子遗传标记（DNAmoleculargeneticmarker）鉴别生药应运而生。道地药材道地药材的形成是基因型与环境之间相互作用的产物，可用公式表示：表现型phenotype=基因型genotype+环境饰变（environmentalmodification）生药DNA分子遗传标记鉴定是指通过比较生药间DNA分子遗传多样性差异来鉴别生药基源，确定其学名的方法。DNA分子是由G、A、C、T四种碱基构成，生物体特定的遗传信息便包含在特定的碱基排列顺序中，这就是生物的遗传多样(geneticdiversity)。在DNA分子上，有编码与物种存活密切相

3、关的基因区域、编码与物种存活不十分密切相关的基因区域和非编码基因区域。基因组DNA的这些不同区域在生物进化过程中所受到的选择压力不同，前者所受选择压力大，表现出高度保守，后者所受选择压力小，表现出较大的变异。正是由于这种DNA分子不同区域承受的选择压力不同，使得DNA分子的不同区域有不同程度的遗传多样性。因此，我们能够选择适当的DNA分子遗传标记，在属、种、亚种、居群或个体水平上对研究对象进行准确地鉴别。下面对生药DNA分子遗传标记鉴定的相关技术和方法作一简单介绍。一、DNA提取技术DNA的提取是现代生物技术进行中药鉴别的最关键步骤。总DNA的有效提

4、取要求材料中的DNA尽可能少的降解。从植物药材中提取DNA一般可分为两个阶段:第一阶段是植物细胞破裂后释放出DNA。第二阶段是DNA与其它细胞组分如蛋白质、碳水化合物、膜和细胞壁相分离，在这个阶段，重要的是要保证大量的DNA不能混杂在细胞碎片中，DNA要与蛋白质和其它污染物完全分离，因为这些污染物的存在会干扰下一步的分析。对于幼嫩器官的材料（鲜品或硅胶快速干燥样品），一般方法都可以得到质量符合要求的DNA。但对于中药材，情况则要复杂得多，需要针对具体材料，设计去除含酚羟基的化合物和多糖类化合物的方法。DNA的质量将直接关系到实验的成败。一般而言，所得

5、的DNA应完整、有足够的量，电泳检查时可给出精确性高、重复性好的迁移带型，此外，还应满足下游操作的要求，如用于PCR分析的DNA不应含干扰PCR反应的污染物。二、琼脂糖凝胶电泳技术琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片段的常用方法，具有简便、快速的优点。DNA琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同。DNA分子是两性电解质，在高于其等电点的溶液（pH8.0~pH8.3）中，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离，DNA分子带负电荷，在电场中向正极移动DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，使分子大小和构象不同的DNA

6、分子迁移率出现较大差异，从而达到分离目的。在凝胶中加入少量溴化乙锭，其分子可插入DNA的碱基之间，因此可在紫外光灯下直接观察到DNA片段在凝胶上的位置，并可在紫外光灯下或经凝胶成像系统观察或拍照。三、PCR技术聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，是一种模拟自然DNA复制过程的体外酶促合成特异性核酸片段技术。PCR技术能在一个离心管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，在EB染色及电泳后，肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞

7、中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。DNA复制特点1.PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮循环作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为

8、反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变