基因工程药物的分离纯化.ppt

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1、第八节基因工程药物的分离纯化基因工程药物的分离、纯化非常重要。表达的产物都是多肽或蛋白质。它的制得具有以下特点：①表达产物在初始料中含量较低；②含有大量细胞及代谢产物；③表达产物稳定性差，易失活变性；④表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异；⑤对其质量要求纯度高、无菌、无热原。一、建立分离纯化工艺的根据⒈含目的产物的起始料的特点基因工程菌的发酵产物其上游过程的各种因素对分离、纯化工艺有影响。包括：①菌种的类型及其代谢特性。②原材料培养基的来源及其质量。③生产工艺及条件。⒉物料中杂质的种类和性质。⒊目的产物特性。⒋产品质量的要求二、分

2、离纯化的基本过程发酵液细胞分离胞内产物胞外产物细胞破碎固液分离浓缩初步分离高度纯化制剂产品包含体细胞碎片分离变性复性三、分离纯化的技术分离纯化的技术要求：①技术条件温和能保持产物生物活性。②选择性好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离，达到较高的纯化倍数。③收率要高。④两个技数间能直接衔接，不需要对物料加以处理。⑤纯化过程要快，满足高生产率的要求。⒈细胞破碎与固液分离⑴细胞收集：离心法、膜分离法。⑵细胞破碎：机械破碎法、非机械破碎法。⑶固液分离⒉目的产物的分离纯化目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。蛋白质分离纯化方法的设计根据其

3、分子的理化性质和生物学特性来决定。产物特性　　作用等电点　决定离子交换种类及条件相对分子量选择不同孔径的介质疏水性与疏水、反相介质结合的程度生物特异性决定亲和配基溶解性决定分离体系及蛋白浓度稳定性决定工艺采用温度及流程时间⒉目的产物的分离纯化目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。产物特性　作用等电点决定离子交换种类及条件相对分子量选择不同孔径的介质疏水性与疏水、反相介质结合的程度生物特异性决定亲和配基溶解性决定分离体系及蛋白浓度稳定性决定工艺采用温度及流程时间产物的特性在

4、分离纯化中的作用分离纯化的方法依赖色谱分离方法⑴离子交换层析（ionexchangechromatographyIEC）离子交换层析的基本原理是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。它具有分辨率高容量大操作容易，该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要方法。⑵反相色谱（reversedphasechromatography，RPC）和疏水色谱（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。反相色谱是利用溶质分子

5、中非极性基团与非极性固定相之间相互作用力的大小以及溶质分子中极性基团与流动相中极性分子之间在相反方向作用力的大小差异进行分离的。常用固定相为硅胶烷基键合相。流动相为低离子强度的酸性水溶液，加入能与水互溶的乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂。由于固定相骨架疏水性强，吸附的蛋白质需用有机溶剂才能洗脱下来。疏水色谱的原理与反相色谱的原理相似，主要是利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，无机盐的存在能使相互作用力增强。固定相介质表面的疏水性比反相色谱介质表面的疏水性弱。为有机聚合物键合相或大孔硅胶键合相。流动相为pH6～8

6、盐水溶液。在高盐浓度时，蛋白质分子中疏水性部分与介子的疏水基团产生疏水性作用而被吸附；盐浓度降低时蛋白质疏水性作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来，蛋白质疏水性越强，洗脱时间越长。与反相色谱相比，疏水色谱回收率较高，蛋白质变性可能性小。⑶亲和层析（affinitychromatography，AC）亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。配基：在亲和层析中起可逆性结合的特异性物质。载体：与配基结合的支撑物。亲和层析大体可分三步：①配基固定化②吸附目的物③样品解吸⑷凝

7、胶过滤凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子的动力学体积的大小差异，可以利用凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。主要应用两个方面：①脱盐和更换缓冲液②蛋白质分子的分级分离。在产品的形成阶段前用于除去产物的多聚体及降解产物。⒊非蛋白质杂质的去除DNA、热原质和病毒的纯化方法：⑴DNA的去除DNA在pH4.0以上呈阴离子，蛋白质的pI在6.0以上,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性，可选择

8、条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。亲和层析和疏水层析也有效。⑵热原质的去除热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除