HPLC高效液相色谱法培训课件.ppt

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1、高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatographyHPLC1讲授提纲HPLC仪器HPLC基本操作HPLC使用注意事项HPLC分类分析中的实际问题2Agilent1100仪器31HPLC的组成及工作流程1螺旋注射泵2往复柱塞泵3往复隔膜泵4气动放大泵1自动进样器2手动进样器1液固2液液3键合相色谱4离子交换5空间排阻1紫外检测器2荧光检测器3蒸发光散射4示差折光检测器5电化学检测器6电导检测器7质谱检测器色谱柱是高效液相色谱仪的“心脏”，是实现色谱分离的基础。4仪器组成高压输液系统进样系统色谱分离系统检测系统数据处理系统5仪器组成高压输液系

2、统进样系统分离系统检测系统数据处理系统6高压输液系统溶剂贮液瓶溶剂脱气装置高压输液泵梯度洗脱装置7溶剂贮液瓶用途：贮存流动相溶剂材料：玻璃或塑料，无色或棕色，容积：约为0.5～2.0L位置：高于泵，以保一定的输液静压差。8溶剂脱气装置真空脱气机在线真空脱气机可实现流动相在进入输液泵前的连续真空脱气，适用于多元溶剂系统。简单的高效液相色谱仪无在线脱气装置，流动相必须用离线脱气法。9真空脱气机10溶剂脱气方法离线脱气法抽真空脱气超声波振荡脱气吹氦脱气在线脱气法11抽真空脱气——常用方法用微型真空泵，降压至0.05~0.07MPa即可除去溶解的气体。使用真空泵连接抽滤瓶可以一起

3、完成过滤和脱气的双重任务。滤膜常用0.45μm，分有机相和水相膜，切不可用水相膜过滤有机相。12将流动相置于超声波清洗机中，用超声波振荡10~30min，即可。用在液体中比空气中溶解度低的氦气，以60mL／min的流速缓缓地通过流动相10~15min，除去溶于流动相中气体。超声波振荡脱气吹氦脱气13高压输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。输液泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。14输液泵应具备的性能①流量稳定，其RSD应＜0.5%。对定性定量的准确性至关重要。②流量范围宽，分析型应在0.1~10ml/min范围内连续可调，制备型能达到100ml/m

4、in。③输出压力高，一般可高达400~500kg/cm2。④液缸容积小，适于梯度洗脱。⑤密封性好，耐腐蚀。15输液泵类型1螺旋注射泵2往复柱塞泵3往复隔膜泵4气动放大泵目前应用最多的是柱塞往复泵。16泵的使用与维护防止任何固体微粒进入泵体，因此应过滤流动相。流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应停泵过夜或保留在泵内更长时间。必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于保存色谱柱和有利于泵维护的溶剂。17泵的使用与维护防止流动相耗尽空泵运转，导致柱塞磨损、缸体或密封损环，最终产生漏液。输液泵的工作压力不能超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液(40M

5、Pa,400bar,5800psi)。流动相应脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。18梯度洗脱装置用途：梯度洗脱。等度(isocratic)高效液相洗脱方式梯度(gradient)低压梯度（外梯度）梯度洗脱方式高压梯度（内梯度）19低压梯度在常压下将两种或多种溶剂按一定比例输入泵前的比例阀中混合后，再用高压泵将流动相以一定的流量输出至色谱柱。常见的是四元泵，如waters2690/2695；Agilent1100。特点：只需一个高压输液泵，由计算机控制四元比例阀来改变溶剂比例，实现二元~四元梯度洗脱，成本低廉、使用方便。由于溶剂在

6、常压下混合，易产生气泡，需要良好的在线脱气装置。20梯度洗脱系统（低压梯度）21高压梯度一般只用于二元梯度，即用两个高压泵分别按设定比例输送两种不同溶液至混合器，在高压状态下将两种溶液进行混合，然后以一定的流量输出。主要优点：只要通过梯度程序控制器控制每个泵的输出，就能获得任意形式的梯度曲线，且精度很高，易实现自动化控制。如：waters51522梯度洗脱系统（高压梯度）23进样系统作用：将试样引入色谱柱位置：在高压泵和色谱柱之间类型：手动或自动进样器：六通阀24进样器手动六通阀经注射器进样自动六通阀圆盘式自动进样器链式自动进样器2526六通阀手动进样器原理示意图Load

7、Inject27六通阀有6个接口，1和4之间接定量环，2接高压泵，3接色谱柱，5、6接废液管。定量环常见体积有5、10、20、50μL等，可以根据需要更换不同体积的定量环。28手动进样器用微量注射器将样品溶液注入六通阀注意必须使用HPLC专用平头微量注射器，不能使用气相色谱尖头微量注射器，否则会损坏六通阀。进样方式：有部分装液法和完全装液法29进样方式①部分装液法：注入的样品体积应不大于定量环体积的50%，并要求每次进样体积准确、相同。②完全装液法：注入的样品体积应最少是定量环体积的3倍，以完全置换定量环内流动相，消除管壁效应