人巨细胞病毒(HCMV)荧光定量.pdf

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1、人巨细胞病毒（HCMV）荧光定量PCR检测试剂盒说明书V.070528人巨细胞病毒（HCMV）荧光定量PCR检测试剂盒说明书【产品名称】通用名称：人巨细胞病毒（HCMV）荧光定量PCR检测试剂盒英文名称：HCMVPCRFluorescenceQuantitativeDetectionKit【包装规格】48人份/盒【用途】本试剂盒用于人尿液或痰液中人巨细胞病毒核酸（HCMVDNA）的定量检测。【检验原理】本试剂盒选用人巨细胞病毒株（即人疱疹病毒5型）-AD169基因组中编码即刻早期转录调节蛋白的IE基因的一段高

2、度保守的非编码区为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针；利用实时荧光定量Taqman探针法并结合竞争性内标技术，来定量检测人尿液或痰液中人巨细胞病毒核酸（HCMVDNA）的拷贝量。本试剂盒可用于临床对人巨细胞病毒的辅助诊断和抗病毒药物的疗效观察。【主要组成成份】试剂盒组成数量成份提取样本浓缩液A4.8ml×1含有PEG8000的溶液裂解液B960μl×2含有Tris碱缓冲液核酸扩增试剂HCMVPCR反应液835μl×2含有引物、探针和dNTP的溶液Taq酶(5U/μl)14.4μl×1Taq酶UDG酶4.8μ

3、l×1UDG酶内标48μl×1含有适量的非HCMV基因片段的非传染性DNA对照品阴性对照品200μl×1HCMVDNA阴性的混合尿样临界阳性对照品200μl3×1含有约10Copies/ml的HCMV基因片段的非传染性DNA6Copies强阳性对照品200μl×1含有约10/ml的HCMV基因片段的非传染性DNA77Copies工作标准品工作标准品1：（1-5）×10Copies/ml40μl×1含有约10/ml的HCMV基因片段的非传染性DNA66Copies工作标准品2:（1-5）×10Copies/ml

4、40μl×1含有约10/ml的HCMV基因片段的非传染性DNA55Copies工作标准品3:（1-5）×10Copies/ml40μl×1含有约10/ml的HCMV基因片段的非传染性DNA44Copies工作标准品4:（1-5）×10Copies/ml40μl×1含有约10/ml的HCMV基因片段的非传染性DNA工作标准品1-4的参数因批号而异，详见试剂盒盒内标签。工作标准品1-4使用已获国家SFDA批文的HCMV定量检测试剂盒标定的企业质控品进行标定。【储存条件及有效期】1）试剂盒必须在冷冻条件下运输。2）

5、试剂盒保存：试剂盒须-20℃以下保存，应避免反复冻融。3）有效期：本试剂盒有效期12个月，请在有效期内使用。1/3人巨细胞病毒（HCMV）荧光定量PCR检测试剂盒说明书V.070528【适用仪器】博日公司恒温金属浴系列或水浴和Line-Gene系列荧光定量PCR检测系统及其他厂家同类荧光定量PCR检测系统。【样本要求】1样本采集：用无菌的干燥玻璃管取受检者晨尿10ml，即为尿液标本。痰液使用一次性痰液收集器采集，最好留取早晨第一口痰液。痰液收集后应尽快送检。在痰液标本中加入两倍体积生理盐水溶液(自备)，混合均

6、匀。2存放：待测标本保存于-20℃，但应避免反复冻融。3运输：标本运输应采用泡沫盒加冰袋。【检验方法】(一)标本提取（在标本处理区进行）取待测尿液或液化痰液100μl，加到0.5ml离心管中；加入100μl浓缩液A，振荡混匀，13,000rpm离心10min；吸弃上清。注意：尽可能吸弃上清且不碰沉淀；加入40μl裂解液B，剧烈振荡，100℃干浴或沸水浴10min；13,000rpm离心10min，保留上清备用。此提取液保存于-20℃。（二）PCR反应液配制（在试剂准备区进行）1试剂配制：将试剂盒中的HCMVP

7、CR反应液、工作标准品及对照品进行室温解冻。试剂配制前，将所有试剂振荡后短暂离心。按标本的数量（n个）加上工作标准品（4个）、对照品（3个）和阴性（1个）的数量进行PCR反应配制（n+8）个，配制方法如下：试剂PCR反应液内标Taq酶UDG酶单人份用量34.6μl1μl0.3μl0.1μl配制量（n+8）×34.6μl（n+8）μl（n+8）×0.3μl（n+8）×0.1μl混合好上述反应液后，以每管36μl分装于（n+8）个200μl的PCR反应管中。2加样：分装好的反应管分别加入已提取好的标本、对照品及工

8、作标准品各4μl。3PCR反应反应程序设置如下：37℃：5分钟；94℃：1分钟；94℃：5秒；40个循环60℃:40秒；仪器检测通道选择:荧光信号收集设定为F1（FAM）、F2（HEX）通道。Line-gene系列荧光定量PCR检测系统运行之前，设置程序在60℃运行10秒，检测荧光本底值，调节增益使荧光F1、F2通道本底值在20-30之间。【质量控制】1标准曲线的相关系数绝对值大于等于0.970，阴